Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
пробах 10 и 5 мкл. В этом случае Д = = 100 • 100/25 = 400 мл; W = 20 г; V
= 15 мкл; С = 400 • 400/20 X X 15 = 534 мкг/кг.
Подобный расчет при условии нанесения на хроматограмму серии проб одного
разведения, объем которых возрастает в арифметической прогрессии (1, 2,
3, 4, мкл и т. д.), позволяет определять содержание афлатоксина в образце
с точностью до нескольких микрограммов.
Х.3.6.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНОВ В ПОРАЖЕННЫХ
СУБСТРАТАХ [597]
На первом этапе обезжиривают субстрат смесью гексан - метанол - вода (1 :
1 : 1) и отделяют водно-метаноловый слой. К водно-метано-ловому слою
добавляют промытый кислотой целит 545, наполняют смесью
хроматографическую колонку; промывают гексаном, затем смесь# г^ксзн -
хлороформ (1 : 1), Элюат гексан - хлороформ со-
Таблица 24. Определение концентрации афлатоксина [294]
Номер пробы на ТСХ- плас- тинке Концентрация афлатоксина Bt в
исследуемом образце продукта, мкг/кг Степень токсичности
1 Более 1000 Очень ток-
сичный
2 250-1000 Токсичный
3 50-250 Слабо ток-
сичный
4 5-50* Нетоксичный
* Отсутствие флюоресценции позволяет считать, что исследуемый образец
приктически не содержит афлатоксинов.
аю
держит афлатоксины. Растворитель удаляют выпариванием досуха и добавляют
определенный объем хлороформа. Раствор хроматографируют на тонком слое
силикагеля и разделяют смесью хлороформ-метанол (93 : 7). По степени и
качеству флюоресценции в УФ-лучах и сравнению значений Rf с известными
образцами определяют наличие афлаток синов в исследуемом продукте.
Количество афлатоксина (мкг/кг) определяют по формуле Si = SyXV/XW, где 5
- количество стандартного раствора афлатоксина В^, соответствующее
неизвестному (мкл) у - концентрация стандартного раствора афлатоксина В*
(мкг/мл) V - объем конечного разведения экстрагированного образца (мкл) X
- количество экстрагированного образца, дающего флюоресцен цию,
аналогичную стандартному раствору В* (мкл); W-масса образца (г),
использованного для экстракции в колонке целита.
Для хроматографии в тонком слое в качестве растворителей используют также
ацетон - хлороформ (1 : 9), прямое экстрагирование хлороформ из водных
растворов образца и др.
Х.3.6.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНОВ МЕТОДАМИ
ТОНКОСЛОЙНОЙ И КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Неочищенный препарат афлатоксинов хроматографируют на пластинках тонкого
слоя (до 3 ммк) окиси алюминия, содержащего 15% сульфата кальция, или на
силикагеле, содержащем около 13% суль-
# Рис. 111. Тонкослойная хроматограмма
0 Bt 0 смеси афлатоксинов (адсорбент - силика-
0 (r) В Ш гель, растворители - ацетон, хлороформ).
Pf
0,5
0
0
О 25 5 75 10 15
Ацетон, %
Рис. 112. Тонкослойная и колоночная хроматограммы смеси афлатоксинов: а -
- фракционирование смеси афлатоксинов на колонке (8X500 мм; сефадекс-10;-
элюат-. 1%-ный раствор метанола); б- хроматографическое разделение смеси
афлатоксинов в тонком слое силикагеля.
м
Время, мин
I I_________________________________I I
3 5 /4 !д 34 46 Номер пробирка
f
311
фата кальция (силикагель g). Растворители - хлороформ, метанол, этанол,
ацетон, гексан, этилацетат, бутанол или смеси любого из двух этих
растворителей. Хроматография восходящая. Наиболее успешное разделение по
значению Rf наблюдается на тонком слое силикагеля g, когда в качестве
растворителя используют ацетон (от 5-10%) в хлороформе.
При колоночной хроматографии применяются колонки 8 X 500; 10 X 300, 15 X
300 мм, которые заполняют соответственно процедуре силикагелем,
сефадексами g-10, g-25 или gLH (Merk), окисью алюминия. Элюенты -
хлороформ, метанол, этанол, ацетон, вода и др. Количество токсина
определяют по оптической плотности раствора при длине волны УФ-лучей 365
нм на спектрофотометре. Наилучшие результаты получены при
хроматографировании на колонке сефадек-са g-10 и элюировании 1%-ным
раствором метанола (рис. 111, 112).
Х.3.6.5. РАЗДЕЛЕНИЕ ДЕНДРОДОХИНОВ КОЛОНОЧНОЙ
И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
Концентрированный раствор неочищенной смеси токсинов в хлороформе
помещают на заполненную мокрым способом колонку окиси алюминия 18 X 180
мм (активность не ниже 2-й степени). Затем последовательно промывают
петролейным эфиром, хлороформом, 5%-ным метанолом в хлороформе,
метанолом. Фракция петролейного эфира - содержит липиды, хлороформа -
дендродохины Дх, Д2, Д3; 5%-ного метанола в хлороформе-дендродохины Д2,
Д4, Д5, метанола - сахара. Повторно хроматографируют концентрированные
растворы полученных фракций. Разделение контролируют хроматографически на
тонком слое алюминия, растворитель - петролейный эфир - хлороформ -
метанол (10 : 5 : 1). Проявляют в парах йода в эксикаторе [299].
Х.3.6.6. ОДНОВРЕМЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕСКОЛЬКИХ
МИКОТОКСИНОВ [274]
Метод одновременного определения афлатоксинов В1} В2, Gx, G2, охратоксина
А, зеараленона, стеригматоцистина и патулина на пластинках "Силуфол"
является модификацией метода Столоффа.
Экстракция. 50 г измельченного зерна, проходящего через сито с диаметром
