Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Кантареро и соавторы исследовали сорбцию ряда меченных ,251 белков на стенках пробирок из полистирола в зависимости от концентрации белковых растворов. Сорбция шла из тонкого слоя, при вращении пробирок в течение 3 ч при 37°. Белки были растворены в 0,1 М карбонатном буфере, pH 9,6. Затем стенки пробирок тщательно промывали 0,9%-ным раствором NaCl с детергентом (0,05% Твин-20). Для семи белков (БСА, овальбумина, лактальбумина и четырех различных иммуноглобулинов) было найдено, что вплоть до концентрации 1 мкг/мл количество прочно сорбированного белка линейно зависело от исходной концентрации белкового раствора и составляло от 10 до 80% (IgM) вносимого в пробирку белка. Далее следовало насыщение или дополнительное связывание уже за счет взаимодействия типа белок—белок. Первоначальное (линейное) связывание покрывает поверхность полистирола монослоем молекул белка [Сап-tarero et al., 1980].
Романи и соавторы для проведения радиоиммунных определений различных белков хроматина, в частности HMG-1, в качестве твердофазного носителя использовали гибкие платы для микротитрования на 96 лунок, изготовленные из полихлорвинила. В лунки вносили по 0,1 мл белкового раствора в обычном фосфатно-солевом буфере, выдерживали 4 ч при комнатной температуре, а затем ночь на холоду (концентрации белка указаны ниже). Не сорбировавшиеся на пластик белки смывали шестью порциями по 0,3 мл того же раствора. Для блокирования центров сорбции на пластике, оставшихся незанятыми, лунки заполняли 1%-ным раствором БСА в фосфатно-солевом буфере, инкубировали и отмывали, как описано выше. Затем в лунки вносили по ОД мл иммунной антисыворотки кролика, разбавленной в отношении 1 :200 тем же раствором БСА, инкубировали 4 ч при комнатной температуре с покачиванием и промывали 8 раз буфером. Наконец, для обнаружения связавшихся антител добавляли по ОД мл раствора [12*1]-белка А (10—50 тыс. имп./мин), инкубировали еще 4 ч, трижды тщательно промывали раствором ЬСА, 8 раз —буфером и 10 раз —водой. После этого лунки вырезали из платы и поочередно просчитывали в у-счетчике.
На рис. 77 приведена кривая нарастания связанной с пластиком радиоактивности в зависимости от концентрации антигена (HMG-1) в исходном белковом растворе. Легко видеть, что при концентрации 2 мкг/мл имеет место насыщение сорбционной способности полихлорвинила.
Рассмотренный метод прямого обнаружения антигена позволяет обнаруживать 2Х10"2 мкг HMG-1 (ОД мл при концентра-
=3
-f)—u-<--------1----I—t--------i-l
0 12 4 8 16 3264
Разёадление сыворотка, *100
0,1 1 2 5 10 20
Концентрация HMG~lt ике/мл
Рис. 77, Кривая связывания радиоактивности белка А с пластиком в зависимости от концентрации HMG-1 в исходном белковом растворе (см. текст)
Рис. 78. Уменьшение радиоактивности, связанной на пластике, с разбавлением антисыворотки при условии, что пластик исходно насыщен антигеном (см. текст)
1 1 1 14—
0,1 1 10 too
Содержание HMG-1, мкг
Рис. 79. Калибровочная кривая для КРИМ с использованием пластика в качестве твердой фазы при определении содержания HMG-1 [Romani et al., 1980].
ции 0,2 мкг/мл). Его легко преобразовать в КРИМ. Для этого плату насыщали антигеном, сорбируя его из заведомо избыточной концентрации 10 мкг/мл. Испробовав различные разбавления сыворотки, можно было найти (рис. 78), что, начиная от разбавления 1 : 100, она в указанных выше условиях эксперимента оказывалась в недостатке — количество связываемой радиоактивности снижалось. Взятую в таком разбавлении антисыворотку предварительно инкубировали с равным объемом раствора антигена, варьируя его концентрацию в широких пределах (рис. 79). В ходе прединкубации часть антител связывалась с антигенами в растворе и не участвовала в образовании иммунных комплексов на поверхности пластика. Затем раствор предин-кубированных антител вносили в лунки с сорбированным на их поверхности (до насыщения) антигеном и детектировали связавшиеся антитела радиоактивным белком А. Получалась типичная для КРИМ калибровочная кривая, по которой аналогичным образом можно было определять содержание антигена [Romani et al., 1980].
Аналогичный прием был использован для исследования гистонов [Blankstein et al., 1980; Benezra et al., 1981]. Здесь вместо [‘“I]-белка А для детектирования связавшихся с пластиком антител использовали радиоактивно меченную антисыворотку козы против IgG кролика, т. е. систему двух антител.
В заключение отметим, что для удобства проведения серий-яых научных исследований, особенно медицинских, с помощью КРИМ фирмы-поставщики радиоактивных биохимических препаратов предлагают целый список готовых наборов («Radioassay Kits»). В эти наборы входят дозированные количества радиоактивного антигена, «холодного» антигена для построения калибровочной кривой и специфической антисыворотки, а также различные средства преципитации иммунных комплексов — от сульфата аммония и активированного угля (для цАМФ) до твердофазных носителей. Фирма «Beckman» разработала комплект приспособлений («Phase I»), облегчающих проведение таких серийных исследований. Помимо обычных автоматических дозаторов жидкости, в него входят специальные штативы, с помощью которых в приспособленном для этой цели крестообразном роторе обычной центрифуги «Beckman J6» можно центрифугировать одновременно 160 пробирок, простой 7-счетчик на 200 пробирок (в тех же штативах) и микропроцессор на 9 программ, печатающий окончательные результаты определения концентрации антигенов.
