Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
В частности, таким образом исследовали содержание гистонов в нуклеосомах из эритроцитов цыпленка. Вторичные антитела были конъюгированы со щелочной фосфатазой [Romas et al., 1981]. Конъюгация вторичных антител с пероксидазой и их обнаружение в реакции с Нг02 и бензидином недавно были использованы для обнаружения дезоксинуклеотидилтрансферазы, очищенной из тимуса теленка [Bollum, Chang, 1981].
Недавно описан мягкий метод конъюгации ферментов с антителами, обеспечивающий почти полное сохранение активности обоих партнеров [O’Sullivan et al., 1979]. Он открывает дополнительные возможности для постановки иммунохимических экспериментов описанного выше типа в тех случаях, когда радиоактивно меченные вторичные антитела нужной специфичности отсутствуют в продаже или плохо переносят реакции иодирования.
Другая немаловажная область — иммунофлюоресцентный анализ (FIA — «fluoroimmunoassay»)—еще дальше отходит от рассматриваемых в этой книге методов. Дело не только в характере индикаторов, которыми служат флюоресцирующие вещества, конъюгированные с антителами. Более существенно различие объектов исследования и экспериментальных приемов. Объектами здесь служат главным образом антигенные свойства поверхностей клеток или органелл, а среди приемов главную роль играют цитологические подходы с использованием флюоресцентных микроскопов и квантовых фотометров. Поэтому ограничимся лишь ссылками на две недавние работы в этой области [Gillis ег яI.. 1979: Rustin. Neihardt. 19791.
НЕКОТОРЫЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ ОБ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАДИОАКТИВНЫХ ИЗОТОПОВ
В заключение следует дать несколько практических рекомендаций общего характера. Они недостаточно многочисленны и слишком разрознены, чтобы составить отдельную главу, но и не связаны непосредственно с материалами, изложенными в предыдущих главах. Поэтому приведем эти замечания в виде краткого приложения, в порядке простого перечисления.
При исследовании активности фермента радиоактивный субстрат реакции должен находиться в количественном избытке, для тсго чтобы скорость реакции зависела только от наличия фермента, а присутствием эндогенного субстрата в неочищенной ферментной фракции можно было пренебречь. Обеспечивать весь избыток субстрата за счет радиоактивного препарата дорого и не имеет смысла, так как внесение в реакционную смесь радиоактивности порядка 0,1 мкКи обычно вполне достаточно. Даже при включении в конечный продукт всего лишь 1 % субстрата это даст надежно измеряемое значение — 2200 расп./мин. Поэтому, как правило, следует разбавлять исходный радиоактивный препарат «холодным» субстратом, причем сразу для всего количества изотопа планируемой серии экспериментов — не только в интересах надежности сопоставления результатов разных опытов, но и ввиду того, что разбавленные препараты лучше хранятся (меньше сказывается радиационный эффект разрушения препарата).
УА разбавленного препарата, как правило, можно подсчитывать, пренебрегая молярным содержанием самого меченого вещества, так как разбавление происходит в 1000 и более раз.
2. Следует иметь в виду существование изотопного эффекта, т. е. изменения хода реакции или физико-химических характеристик ее продукта за счет замены нормального атома на радиоактивный изотоп, отличающийся по своей массе. Практически с этим обстоятельством иногда приходится считаться при использовании трития, атомная масса которого втрое больше, чем у водорода.
3. Следует учитывать возможность необратимой сорбции изотопа на стекле или целлюлозе (например, на старте при ТСХ). Она может быть особенно заметна при использовании разбавленных растворов радиоактивных препаратов с высокой УА. Предотвратить ее лучше всего разбавлением изотопа «холодным» препаратом или введением немеченного вещества (белка, НК), не участвующего в реакции, но конкурирующего с меченым препаратом в отношении сорбции. Например, на старт пластинки для ТСХ иногда бывает целесообразно предварительно нанести немного «холодного» препарата, а потом уже — смесь радиоактивных веществ, подлежащих разделению.
Инертные в данной реакции полимерные «носители» широко употребляются для соосаждения меченых препаратов из раз-
4. Для обнаружения пятен радиоактивных веществ на пластинках после ТСХ или электрофореза не всегда удобно пользоваться авторадиографией или флюорографией. При малом уровне радиоактивности это отнимает много времени. Значительно проще добавить в исходную смесь избыток «холодных» «свидетелей», разумеется, если состав смеси известен (аминокислоты, нуклеотиды и др.). Соответствующие пятна и полосы в этом случае легко локализовать окраской, а затем вырезать, элюировать или соскрести с пластинки и просчитать радиоактивность в жидком сцинтилляторе.
5. Ферментативные реакции с радиоактивными предшественниками сейчас нередко проводят в очень малых объемах (5— 20 мкл). При этом возникают трудности с быстрым и надежным перемешиванием компонентов инкубационной смеси. Его лучше всего производить при нулевой температуре, а момент начала реакции фиксировать прогреванием смеси, которое для малых объемов проходит достаточно быстро. Проблему испарения и» малого объема в процессе инкубации иногда решают, проводя реакцию в запаянном капилляре.
