Люминесцентный анализ - Шлезингер М.А.
Скачать (прямая ссылка):
По данным Ганда [34], содержание рибофлавина в молоке удобно определять путем сравнения интенсивностей свечения ацетоновой вытяжки из молока, в которую переходит витамин В2, и кубика из стекла, содержащего уранил; флуоресценцию последнего заранее градуируют по растворам рибофлавина определенной концентрации. Таким образом, в этом приеме использован упрощенный метод выделения рибофлавина; кроме
204 Б. ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ В БИОЛОГИИ И ОРГ. ХИМИИ [ГЛ. XII
того, для установления интенсивности флуоресценции применен стандарт, не изменяющийся со временем или под влиянием фотохимических реакций; самые измерения проводятся объективным методом при помощи фотоэлемента. Очевидно, что в такой форме метод становится типичным* экспресс-методом, который позволяет удовлетворить практическую потребность в оценке содержания витамина в различных пробах молока.
Елисеевой [35] описан упрощенный метод определения малых количеств рибофлавина в моче,основанный на измерении интенсивности флуоресценции рибофлавина в водных растворах. Для внесения поправки на флуоресценцию примесей автор предлагает разрушать рибофлавин фотохимическим путем, а именно облучением ртутной лампой ПРК-2 без светофильтра.
В [36] люмифлавинный метод определения рибофлавина в растениях подвергается тщательной экспериментальной проверке. Измерениями яркости свечения хлороформенных растворов кристаллического люмилакто-флавина показано, что определение его содержания еще вполне надежно при концентрации 0,05 у/мл. По сравнению с абсорбционным методом флуоресцентный обладает в 20 раз большей чувствительностью, потери витамина при облучении его щелочных растворов всегда одинаковы. Метод более специфичен, присутствие примесей в меньшей мере сказывается на результатах. Так, в вытяжке из салата содержание витамина, находимое абсорбционным методом, было больше определяемого флуоресцентным методом. Однако по мере удаления примесей содержание, находимое по поглощению, все время снижалось и в конце концов стало равным находимому по флуоресценции. Люмилактофлавин для приготовления стандартного раствора был получен облучением кристаллического лактофлавина;, точную концентрацию стандартного раствора определяли по его абсорбции.
Витамин Вх (аневрин или тиамин). Витамин Bj сам по себе не флуоресцирует; его щелочные растворы легко подвергаются, окислению, причем из витамина Вх образуется соединение желтого цвета - тиохром, обладающее в воднощелочной среде яркой флуоресценцией синего цвета; максимум интенсивности свечения лежит при 460-470 ммк. Для выделения тиамина, например, из биологических жидкостей применяют кислый адсорбент - фуллерову землю; на кислых адсорбентах В, в кислой среде устойчив.
При люминесцентном методе определения витамина Вх [37] водную вытяжку, содержащую витамин в щелочном растворе, окисляют красной кровяной солью K3Fe(CN)e, при этом образуется флуоресцирующий тиохром; его извлекают из реакционной смеси изобутиловым спиртом, и по интенсивности флуоресценции определяют содержание витамина Bj. При этом методе существенно брать для окисления именно нужное количество красной кровяной соли: избыток окислителя, равно как его недостаток, приводят к ошибочным результатам.
Ясно, что все ранее сказанное относительно необходимой тщательности работы в полной мере относится к измерениям интенсивности флуоресценции тиохрома. Как и для рибофлавина, предложены стеклянные стандарты [38]: один для дозировки раствордв, содержащих 0,5 у/мл, другой для растворов концентрации 1,0 у/мл. Метод с успехом применяется для определения витамина Вх в биологических жидкостях. Работа Сток [39] посвящена уточнению методики определения витамина Вх при использовании для измерений интенсивности свечения фотоэлектрического фотометра. Рекомендуется готовить стандартный раствор из сульфата.хинина. Подчеркивается необходимость учитывать склонность крис-
i]
БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫЕ ВЕЩЕСТВА
205
таллов последнего терять кристаллизационную воду. Отмечается, что раствор сульфата хинина концентрации 0,01 г в 100 мл 0,1 н серной кислоты служит исходным, стандартный же раствор готовят стократным разбавлением исходного. Дается упрощенный метод пересчета показаний фотометра на концентрацию витамина.
Интересен опубликованный в 1951 г. доклад подкомитета [40], специально выделенного в США для проведения работы по уточнению тио-хромного метода в применении к определению витамина Ва в злаках и хлебных продуктах, в солоде, дрожжах, мясе и продуктах из них. В докладе сопоставляются результаты анализов одиннадцати различных лабораторий. Установлено, что очистка адсорбцией на обменном силикате дает лучшие результаты, чем отмывание изобутиловым спиртом, что окисление следует проводить заранее приготовленной смесью щелочи и красной кровяной соли, а не добавлять их раздельно, что для отделения тиохрома лучше применять изобутанол, насыщенный водой, а не сухой, что получаемые результаты целесообразно проверять методом добавления навески аневрина к исходному экстракту для проверки потерь в процессе анализа и что для конечного определения содержания аневрина предпочтительно пользоваться непосредственным пересчетом на интенсивность флуоресценции тиохрома, а не калибровочной кривой. Отмечается, что степень точности метода неодинакова в применении к различным продуктам. Предложен новый количественный метод определения витамина Вг, основанный на измерении интенсивности флуоресценции соединения, образующегося при взаимодействии витамина с бромистым цианом [41].
