Люминесцентный анализ - Шлезингер М.А.
Скачать (прямая ссылка):
рН= 9-10.
202 Б. ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ В БИОЛОГИИ И ОРГ. ХИМИИ [ГЛ. XII
Отмечается, что параллельно с потерей биологической активности (хемиотерапевтического действия) изменяются и флуоресцентные свойства: желтый цвет флуоресценции переходит в синий у ауреомицина и в зеленоватый у террамицина; надо думать, что это связано с изменением структуры их молекул. В 1957 г. для количественного определения ауреомицина использована его деградация щелочью [26]. В работе [27] описан флуоресцентный метод количественного определения ауреомицина в крови и моче. Для обнаружения стрептомицина в количествах порядка 1 у/мл
СН2-(СН0Н)3-СН20Н . сн3
Рис. 55. Превращение рибофлавина.
описан косвенный метод, основанный на вытеснении стрептомицином аурамина из флуоресцирующего комплекса аур амии-ну к л еинов ая кислота [28].
г) Витамины. Из числа витаминов яркой флуоресценцией обладает витамин В2 (рибофлавин или прежнее название лактофлавин). Его нейтральные растворы в воде и спирте флуоресцируют желто-зеленым светом; полоса флуоресценции лежит в области 515-613 ммк с максимумом при 535 ммк. Флуоресценция тушится прибавлением кислот и щелочей.
Для витамина В2 характерны легко претерпеваемые им химические изменения, сопровождающиеся изменением его флуоресценции. Так, рибофлавин (6,7-диметил-9-а'-рибитол-изоаллоксазин) при его освещении в щелочном растворе отщепляет 4 атома боковой цепи и переходит в; 6,7,9-триметилизоаллоксазин, называемый люмифлавином (рис. 55). Фотохимическая реакция в нейтральной или кислой среде протекает иначе: от рибофлавина отщепляется боковая цепь целиком и образуется люмихром (6,7-диметилаллоксазин)-соединение, бесцветное в нейтральной и кислой среде и обладающее в водном, спиртовом и хлороформенном растворах типичной флуоресценцией небесно-голубого цвета.
При восстановлении флавинов гйдросульфитом или цинком в кислой среде они переходят в лейкофлавины - соединения, бесцветные и не обладающие способностью флуоресцировать; при встряхивании происходит окисление кислородом воздуха и обратный переход во флавин.
1]
БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫЕ ВЕЩЕСТВА
203
Все эти свойства рибофлавина использованы в различных комбинациях в методах, предложенных для количественного его определения [29]. Обычно ничтожно малые количества витамина В2 приходится определять в многокомпонентных системах в различных пищевых продуктах, в биологических средах, например, в моче, в тканях растений; этим задача определения витамина существенно осложняется. По-видимому, в настоящее время удалось в достаточной мере.успешно преодолеть указанные трудности. Следует помнить, что методики, разработанные для определения рибофлавина в одном виде сырья, например муке, не могут быть безоговорочно перенесены на другие исходные вещества, так как всегда может оказаться, что в них присутствуют следы каких-то флуоресцирующих веществ, которые окажутся не принятыми во внимание.
Как уже указывалось, методы люминесцентного анализа становятся экспресс-методами только после того, как они тщательно разработаны и проверены в лабораторных условиях. Упрощение метода достигается лишь постепенно.
Эволюция флуоресцентной реакции на витамин В2 является хорошей иллюстрацией этого утверждения. Первоначально методы определения рибофлавина слагались из следующих операций: рибофлавин из растительного сырья, из кормов, из муки переводили в водный раствор, затем .адсорбировали (сернистым свинцом по Поволоцкой; другие адсорбенты - фуллерова земля, франконит); из адсорбата элуировали пиридином; в полученном растворе содержание витамина определяли по интенсивности флуоресценции голубого цвета.
Для определения рибофлавина в пшенице и продуктах из нее Гоффер, Алкок и Геддес [30] предложили упрощение метода: рибофлавин извлекают из 0,5 г исследуемого материала 25%-ным раствором хлорцстого калия в 2%-ной уксусной кислоте и содержание его определяют по интенсивности свечения раствора. Согласно указанию авторов их методика позволяет сократить время единичного определения до 60-70 мин. Метод пригоден и для определения витамина В2 в сухом молоке, но неприменим к зеленым растениям. >
В другой работе [31], озаглавленной "Некоторые факторы, влияющие на флуорофотометрическое определение рибофлавина", авторы подчеркивают необходимость учитывать, что с увеличением навески извлечение рибофлавина становится неполным.
Для определения витамина В2 в молоке предложен следующий упрощенный способ [32]: 15 мл 10% треххлоруксусной кислоты прибавляют к 10 мл молока; после часового стояния смесь центрифугируют. 10 мл полученной жидкости нейтрализуют и разбавляют настолько, чтобы было удобно определять концентрацию путем сравнения интенсивности флуоресценции полученного раствора и стандартного. Автор указывает, что концентрация витамина в конечном растворе должна быть меньше 0,12 мг/л.
По данным Гансона [33], интенсивность свечения рибофлавина пропорциональна его концентрации вплоть до содержания витамина 30 у/мл (3-10'5 г/мл)\ в качестве стандарта следует брать раствор именно такой концентрации, а не содержащий 50 у /мл, как предлагалось раньше.
