Люминесцентный анализ - Шлезингер М.А.
Скачать (прямая ссылка):
\/
N
1]
БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫЕ ВЕЩЕСТВА
207
димому, и витамин А можно определять флуоресцентным методом, а именно приемом вторым, т. е. по флуоресценции не самого витамина, а продукта его окисления, получаемого при фотохимической реакции.
В работе 1952 г. Петровская [53] обнаруживает витамин А в глазу крысы по его люминесценции зеленого цвета, наблюдаемой в пигментном эпителии сетчатки глаза, но только после адаптации на темноту.
Количественным люминесцентным методом можно определять и витамин фолиевую кислоту; в работе Андреева и Букина описана соответствующая методика [54]. Предложен метод количественного определения витамина Е (токоферола) по люминесценции его производного фена-зина, который получают в результате проводимых реакций [55]. Люминесцентный анализ применим также к витамину В6 (пиридоксину [56]), витамину В12, а также, судя по японским работам, к витамину С, к некоторым энзимам [57], к пиридиннуклео-тидам [58] и т. д. Описание применяемых у нас люминесцентных методов определения витаминов дано в книге [59], посвященной биохимическим определениям.
д) Порфирины. Среди биологически важных веществ, обладающих способностью флуоресцировать, одно из первых мест принадлежит группе порфиринов. Спектры их флуоресценции хорошо изучены (приложение II, стр. 367) [60]; они ле-
жат в красной части спектра и представлены тремя-четырьмя отдельными полосами, по своему положению
в спектре почти совпадающими у различных порфиринов. В отличие от гематопорфирина, гемоглобин не флуоресцирует; однако, если из его молекулы "вырвать" железо (например, действием концентрированной серной кислоты), то разгорается характерная яркая флуоресценция красного цвета. Поскольку порфирины обладают основными свойствами,' флуоресценция их претерпевает изменения при увеличении концентрации водородных ионов; как видно из приложения II, в кислом растворе все полосы смещены в сторону более коротких длин волн. Сходство спектров флуоресценции отдельных порфиринов затрудняет их идентификацию непосредственно по флуоресценции.
Остроумный метод разработал Финк [61]. Он идентифицировал отдельные порфирины из биологических жидкостей путем сравнения характерных для них кривых зависимости яркости флуоресценции от pH (рис. 56). Этот метод целесообразно применять в тех случаях, когда проводятся повторные анализы, в клинических условиях.
Различными авторами предложены методы обнаружения порфиринов по их флуоресценции в патологических случаях [62], описано хромотографическое разделение и определение по люминесценции различных порфиринов [63], в частности копропорфирина [64] (см. гл. XVI, стр. 299).
Рис. 56. Кривые изменения интенсив ности флуоресценции с изменением pH для различных порфиринов (по цифровым данным Дере):
1 - гематопорфирин; 2- изоуропорфирин; з - уропорфирин.
208 Б. ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ В БИОЛОГИИ И ОРГ. ХИМИИ [ГЛ. XII
е) Адреналин. Люминесцентный метод определения адреналина в крови находит теперь широкое применение и ему посвящено большое число работ.
Как и следует ожидать, соединения с химической структурой адреналина *) не обладают в видимой части спектра флуоресценцией; наблюдаемое едва заметное свечение молочно-синего цвета обусловлено, вероятно, примесями.
Однако в щелочном растворе адреналин флуоресцирует очень ярко, желто-зеленым светом. Если щелочной раствор адреналина готовить в атмосфере азота и на воде, из которой кипячением в атмосфере индиферентного газа удалены следы кислорода, то такой раствор не флуоресцирует. Яркая флуоресценция щелочного раствора адреналина обусловливается продуктами его окисления; это свечение можно использовать для определения концентрации раствора. Однако реакция окисления не останавливается на первой стадии, и в процессе дальнейшего изменения раствор перестает флуоресцировать. Этим свойством адреналина существенно осложняется количественное его определение по интенсивности свечения. Адреналин в концентрированной (приблизительно 25%) щелочи проявляет иное отношение к кислороду: вторая стадия окисления настолько замедлена, что становится возможным использовать измерения яркости флуоресценции растворов для суждения о содержании в нем адреналина. При этом необходимо, чтобы пробирки с анализируемым, а тем более с эталонным растворами были хорошо закрыты пробками.
Ошибки определения при таком простейшем методе [65] достигают 5-10%; следует, однако, учесть, что при применявшихся концентрациях раствора адреналина относительная ошибка в 10% составляет всего 1у, что соответствует тому количеству адреналина, какое Содержится в десятых долях одной капли исходного препарата (1 : 1000). Ясно, что такое количество вещества вообще не улавливается биологическим методом. При всем том данный метод дозировки адреналина не свободен от недостатка, каким страдают и химические методы, а именно не исключена возможность, что при окислении во флуоресцирующее соединение переходят те химически весьма сходные с адреналином примеси, которые являются биологически неактивными или обладают известной токсичностью.Ясно, что корреляция, найденная между яркостью флуоресценции и концентрацией исходного раствора, не исключает указанной возможности.
