Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
гибридизуете ее с клонированной ДНК, кодирующей ген 5S-PHK и различные
фрагменты транскрипционной единицы рибосомной РНК (рис. 9-23,Б). Если на
графике откладывать логарифм значения радиоактивности в зависимости от
дозы ультрафиолетового облучения, то получится прямая линия (рис. 9-23,
Б). Угол наклона такой линии пропорционален расстоянию от промотора до
области гибридизации зонда.
Если вы повторите этот эксперимент с зондом, комплементарным
началу гена VSG, то обнаружите, что транскрипция инактивируется примерно
в 7 раз быстрее, чем в случае зонда 4 транскрипционной единицы рибосомной
РНК.
A. Почему чувствительность транскрипции РНК к ультрафиолетовому
облучению увеличивается по мере увеличения расстояния от промотора?
Б. Сделайте приблизительную оценку того, на каком расстоянии находится
ген VSG от своего промотора. Какое допущение следует сделать, чтобы
определить это расстояние?
B. Вы обнаружили другой ген, расположенный перед геном VSG на
расстоянии примерно 10 т.п.н. Транскрипция этого гена приблизительно на
20% менее чувствительна к инактивации ультрафиолетом, чем транскрипция
гена VSG. Могут ли эти гены транскрибироваться с одного промотора?
9-29 Вы изучаете ДНК-содержащий вирус, который на поздних стадиях
инфекции синтезирует ряд белков в больших количествах. мРНК для одного из
этих белков соответствует рестрикту из середины линейного генома. Чтобы
точно определить локализацию этого фрагмента, вы гибридизуете мРНК с
очищенными рестриктами в условиях, когда стабильными оказываются только
дуплексы ДНК-РНК, а цепи ДНК не спариваются. При изучении дуплексов,
R
152 Глава 9
Рис. 9-24. Гибрид ДНК РНК между мРНК и рестрикционным фрагментом
аденовируса (задача 9-29).
^ ?¦ образовавшихся в ходе гибридизации, вы
видите с помощью!
^ ^ электронного микроскопа структуры,
подобные представленной на!
^ ^ рис. 9-24. Почему на концах гибридов
ДНК-РНК наблюдаются!
одноцепочечные "хвосты"?
\
^ <?N <fN ^
I
З1 а -¦ -• 9-30 З'-Концы эукариотических мРНК в
большинстве случаев определи
G ммм "•••• ют путем расщепления РНК-
предшественника и последующего!
" присоединения ро1у(А)-хвоста длиной от
200 до 300 нуклеотидов!
° Главным сигналом для полиаденилирования
служит последова-1
а ими мм" тельность AAUAAA, расположенная
непосредственно на 5'-конце|
д -^ сайта полиаденилирования. Значение
этого сигнала определял!
~м. а мм. <мм! _ разными способами. Один элегантный
подход заключался в ис-г
с пользовании химической модификации,
которая препятствует спе I
А тш тт >тт ^ цифическому взаимодействию с белком.
Этот метод состоит if
° том, что РНК, содержащую сигнальную
последовательность!
в ¦¦¦ ". в ¦¦ обрабатывают диэтилпирокарбонатом,
который взаимодействует!
а _ с А и G с образованием
карбоксиэтилированных производных!
л - мм. "м. мм. Такая обработка делает модифицированные
сайты крайне чувст-1
д ммм ммм вительными к разрушению анилином в
соответствующих условиях!
*"*•*•*- Если исходные молекулы РНК пометить с
одного конца и обра[
о ботать так, чтобы в среднем на одну
молекулу РНК приходилась!
а >мм .м. одна модификация, то при расщеплении
анилином образуета|
а ммм мм. серия фрагментов, длина которых будет
соответствовать распо
g ммм ммм мм* мм" ложению А и G в РНК (рис. 9-25, дорожка
1). (Этот метод!
jj полностью аналогичен методу определения
последовательности!
а мм* ммм ммм ... нуклеотидов ДНК.)
" -¦ Для определения искомых остатков
А и G модифицированные,
" *" но еще целые молекулы РНК инкубируют с
экстрактом, обеспечь
а -" "-> ммм _м> вающим расщепление и
полиаденилирование. Молекулы РНК
° затем разделяют на ро1у(А)+- и
ро1у(А)~-РНК, обрабатывают
а -" -* анилином и фрагменты анализируют в
геле (дорожки 2 и 3). Во
с второй пробе к экстракту добавляют
ЭДТА, что препятствует
а ммм ммм ммм ммм полиаденилированию, но не влияет на
расщепление. Расщепленные
а ммм мм* ммм мм* молекулы затем выделяют, обрабатывают
