Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
__Р. Полагают, что деконденсированные хромосомы в интерфазньв
клетках в значительной степени переплетены между собой.
9-25 Вы измучились с определением факторов специфической трак крипции:
все процедуры довольно длительны, а факторы чага оказываются
нестабильными. К тому моменту, когда вам наконе: удается идентифицировать
искомую фракцию, фактор уже теряв свою активность. И вот в один
прекрасный день вам в голов! приходит блестящая идея по поводу того, как
ускорить определ| ние. Вы придумали, что можно получить последовательное#
ДНК, не содержащую С, встроить ее рядом с промотором и прс- ,
инкубировать такую конструкцию в соответствующей реакци" ной смеси. В
этом случае с промотора будут синтезироваты. транскрипты, не содержащие
G. В отсутствие GTP на сконструированной вами последовательности ДНК
будет синтезировать! единственный длинный транскрипт РНК. Если это
удастся пои зать, то вы сможете легко определять специфическую транскрн|
цию, просто измеряя включение меченого нуклеотида. [
Для проверки своей идеи вы конструируете две плазмид]! несущие
такие тест-последовательности ДНК: одну плазмиду § промотором из
аденовируса (pMLl) и другую без него (рС1). В| смешиваете каждую из этих
двух плармид с очищенной РНК-пол| меразой II, вашими лучшими препаратами
факторов транскри| ции и 32Р-СТР. Кроме того, вы добавляете в разных
сочетаний GTP, РНКазу Т1, разрезающую РНК рядом с каждым G, и 3 Я метил-
GTP, ' который при включении в растущую цепь РН1 терминирует
транскрипцию. Вы определяете продукты реакцв с помощью гель-
электрофореза, результаты которого показаны в рис. 9-21.
A. Почему транскрипт размером 400 нуклеотидов, отсутствующий! \ >¦
дорожке 4, присутствует на дорожках 2, 6, и 8?
Б. Можете ли вы определить, почему происходит синтез в образц;
нанесенном на дорожку 3, где взята плазмида, не несущая пр ¦ мотора?
!
B. Почему транскрипт размером 400 нуклеотидов присутствует i i
дорожке 5, а на дорожке 7 отсутствует? i
Г. Вы разработали этот хитроумный метод, чтобы определить факк ры
транскрипции. Один из ваших коллег замечает, что идентиф J кацию нужно
проводить сначала в грубых экстрактах, котори: содержат GTP. Сможете ли
вы определить специфическую тран!' крипцию в грубых экстрактах? Как это
сделать? j
9-26 Используя свой быстрый метод определения специфической трав!
Клеточное ядро 149
he. 9-21. Строение тест-плазмид Щ н результаты определения [скрипции
при разных условиях (К) (задача 9-25). Во все реакцион-е смеси добавляли
РНК-поли-азу II, факторы транскрипции згр-стр Наличие других компо-ов
отмечено над каждой >жкой: (+) означает,'что ком-присутствует в
реакционной (-) означает, что компонент 1ует.
А. ТЕСТ-ПЛАЗМИДЫ
Промотор аденовируса *
Транскрипт, устойчивый /к РНКазе Т1
Синтетическая вставка (400 п.н,)
pML1
Вектор
рС1
вектор
Б. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ IN VITRO
Плазмида С ML С ML С ML С ML
GTP - - + + + + + +
РНКаза T1 З'-О-метил-GTP - -
- +
+ + +
- + 4-
400 нуклеотидов -
крипции (см. задачу 9-25), вы устанавливаете, что транскрипция
нарастает линейно в течение часа и затем выходит на плато. Объем
реакционной смеси при определении составляет 25 мкл, и в ней присутствуют
ДНК-матрица в концентрации 16 мкг/мл (плазмида pMLl длиной 3,5 т.п.н.) и
другие компоненты в избытке. По специфической активности 32Р-СТР и общей
радиоактивности транскриптов вы вычисляете, что к моменту достижения
плато включилось 2,4 пмоль СМР. Каждый транскрипт имеет в длину 400
нуклеотидов и суммарный состав C2AU. (Масса одной нуклеотидной пары
составляет 660 дальтон.)
A. Сколько транскриптов образуется в ходе реакции?
Б. Сколько матриц участвует в каждой реакции?
B. Сколько транскриптов в расчете на одну матрицу образуется в ходе
этой реакции?
9-27 Как упаковка ДНК в хроматине влияет на транскрипцию у эукариот? Вы
предполагаете решить эту задачу в лоб, используя не содержащую С
транскрипционную единицу (полученную в задаче
9-25). Эта матрица хорошо транскрибируется в присутствии РНК-
полимеразы II и четырех факторов транскрипции-TFIIA, TFIIB, TFIID и
TFIIE.
Для изучения влияния хроматина на транскрипцию вы сначала
упаковываете матрицу в нуклеосомы (используя экстракт из ооци-тов
лягушки), выделяете хроматиновую матрицу и затем добавляете компоненты,
необходимые для транскрипции. Транскрипция не идет (рис. 9-22, дорожка
2). Тогда вы пытаетесь проделать все это в ином порядке. Сначала вы
инкубируете матрицу с компонентами, необходимыми для транскрипции, но в
