Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
последовательностями мыши и обобща ной последовательностью, тогда как
олигонуклеотиды, несущ консервативную последовательность человека, не
оказывают ниш кого влияния. Два олигонуклеотида, проявляющие ингибируют
действие, также вызывали исчезновение из экстракта молек; мяРНК,
состоящих из 63 нуклеотидов. Вам удалось выдели эту мяРНК и определить
последовательность на ее 5'-кош (рис. 9-26, В).
А. Объясните смысл эксперимента с олигонуклеотидами. Что I пытались
узнать, инкубируя экстракт с олигонуклеотидами ДБ в присутствии РНКазы Н?
Б. В опыте был использован экстракт из клеток человека, поэтому к
удивило, что олигонуклеотид, содержащий консервативную поел довательность
человека, не подавлял процессинг, а олигонуклеот! ды, содержащие
консервативную последовательность мыши обобщенную последовательность,
ингибировали его. Какое обы нение вы можете предложить?
9-32 Вы только что распечатали на компьютере все последовательное!
ДНК для семейства генов р-глобина и берете эту кипу лист! с собой
на дачу, чтобы заняться ею в выходные дни. II просмотре распечатки вы
обнаруживаете, что забыли указан с каким участком гена имеете дело. Вам
известно, что последов тельности, представленные на рис. 9-27,
расположены на одной! границ-экзон/интрон или интрон/экзон, и что эта
граница npojf дит по пунктирной линии. Вы знаете также, что интроны веет;
начинаются динуклеотидами GT и заканчиваются AG, но пой маете, что эти
специфические последовательности могут би расположены либо в начале, либо
в конце интрона (рис. 9-27). |
Если вы не сможете определить, с какой стороны от пункт(r) ной
линии расположен интрон, вам придется, несмотря на выхо) ные дни,
вернуться в город. От отчаяния вы пытаетесь разрешу задачу с эволюционной
точки зрения. Вы знаете, что интро*
Интрон
Экзон | GT AG| Экзон |
Интрон.
| Экзон |GT ]
GGTGGTGAGGCCCTGGGCAGi GTAGGTATCCCACTTACAAG - Корова
GGTGGTGAGATTCTGGGCAG| GTAGGTACTGGAAGCCGGGG - Горилла
GGGGGCGAAGCCCTGGGCAG! GTAGGTCCAGCTTCGGCCAT - Курица
GGTGGTGAGGCCCTGGGCAG| GTTGGTATCAAGGTTACAAG - Человек
GGTGGTGAGGCCCTGGGCAG! GTTGGTATCCAGGTTACAAG - Мышь
GGTGGTGAGGCCCTGGGCAG! GTTGGTATCCTTTTTACAGC - Кролик
GGCCATGATGCCCTGACCAG GTAACTTGAAGCACATTGCT - Лягушка
AG Экзон '
Интрон
Рис. 9-29.
Sl-картир! затравки ( 5'-концов 9-33).
Клеточное ядро 155
Рис. 9-28. Расположение четырех генов актина у нематоды (задача
9-33). Гены обозначены стрелками, указывающими направление их
транскрипции.
Рис. 9-29. Использование методов Sl-картирования (А) и удлинения
затравки (Б) для определения У-концов актиновых мРНК (задача 9-33).
v с Ген 1 Ген 2
Ген 3
тосома ^~ен к
-------------------и-тжф-----------------------
меняются быстрее (в них чаще происходят нуклеотидные замены), чем
экзоны, так как изменения последовательностей интронов не затрагивают
функцию. Поможет ли такой подход идентифицировать интрон или вам придется
собираться в дорогу?
9-33 Вы изучаете контроль на уровне транскрипции при синтезе актина у
нематод. У этих животных актиновую мРНК кодируют четыре гена: три из них
расположены рядом на хромосоме 5 (последовательности генов 1 и 3
идентичны), и еще один локализован на Х-хромосоме (рис. 9-28). Для
определения точки начала транскрипции вы используете два подхода: S1 -
картирование и удлинение затравки (рис. 9-29).
Для определения 5'-конца методом Sl-картирования вы гибри-
дизуете радиоактивный одноцепочечный сегмент, расположенный на 5'-конце
гена, с соответствующей мРНК, затем обрабатываете гибрид нуклеазой S1,
чтобы удалить все одноцепочечные участки и анализируете защищенный
фрагмент радиоактивной ДНК с помощью электрофореза в денатурирующем геле,
чтобы определить его длину (рис. 9-29,А). При использовании метода
удлинения затравки вы гибридизуете специфические олигонуклеотиды по
отдельности с каждой из мРНК (гены 1 и 3 идентичны), наращиваете эти
олигонуклеотиды до 5'-конца мРНК и анализируете получившиеся фрагменты
ДНК в денатурирующем геле (рис. 9-29, Б).
В случае гена 4 результаты, полученные этими двумя методами,
совпадают. Однако для генов 1, 2 и 3 длина мРНК, полученная методом
удлинения затравки, оказывается на 20 нуклеотидов больше. При сравнении
последовательностей мРНК (их можно определить методом удлинения затравки)
с последовательностями
S1 -
картирование 5'
9........
Кэп
