Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
мешочка и медленном выпускании из него раствора некоторые цепи ДНК
прилипают к стенкам и растягиваются в направлении тока жидкости. Этот
метод позволяет выделить в интактном виде очень длинные цепи ДНК. При
этом из-за натяжения цепей репликационные глазки смыкаются, в результате
чего дочерние дуплексы лежат бок о бок. Мешочек с прилипшими к нему
цепями ДНК укрепляют на предметном стекле, покрывают фотоэмульсией и
экспонируют от
3 до 6 мес. Меченая ДНК проявляется в виде треков из зерен серебра.
Для синхронизации клеток на этапе начала S-фазы вы подвергаете
их предварительной обработке. В одном варианте опыта вы прекращаете
блокаду синтеза, применяемую для синхронизации, и немедленно вводите 3Н-
тимидин. Через 30 мин вы промываете клетки и заменяете среду, так чтобы
концентрация метки составляла около 30% от первоначальной. Еще через 15
мин вы готовите ДНК для радиоавтографии. Результаты этого эксперимента
приведены на рис. 9-14, А. Во втором варианте опыта вы прекр ' даете
блокаду синтеза, применяемую для синхронизации, затем ждете
30 мин и только тогда добавляете 3Н-тимидин. Через 30 мин инкубации
с 3Н-тимидином вы вновь меняете среду, чтобы снизить
142 Глава 9
Рис. 9-14. Результаты радиоавтографии в эксперименте по изучению
репликации ДНК в культивируемых клетках (задача 9-18). А. Клетки помечены
сразу после прекращения синхронизирующей блокады. Б. Клетки помечены
через 30 мин после прекращения синхронизирующей блокады.
Рис. 9-15.
форез мо нием (А), ным репл двумя ра: метрично ционным В верхнее
жены про зующиеся условногс 1 т. п. н. I показано, J процесса ются в ге
концентрацию меченого тимидина, и инкубируете клетки еш 15 мин.
Результаты второй серии экспериментов приведены i рис. 9ЛА,Б.
A. Объясните, почему в обоих экспериментах некоторые учасп треков
оказались плотно заполненными гранулами серебра (те! ные участки), а
другие-менее плотно (светлые участки).
Б. В первом опыте каждый трек имеет центральную темную част и светлые
участки на каждом конце. Во втором опыте светлы участок есть только на
одном конце каждого трека. Объяснит! почему наблюдается такая разница в
результатах этих двух эксш риментов.
B. Определите скорость движения репликативной вилки (мкм/мш в этих
экспериментах. Совпадают ли результаты, получении в двух опытах? Можно ли
использовать эти данные для топ чтобы определить, сколько времени
необходимо для репликац! всего генома?
9-19 Полагают, что автономно реплицирующиеся последовательное!
(ARS), сообщающие стабильность плазмидам дрожжей, являютс точками
начала репликации. Однако доказать это весьма сложи Трудность состоит
главным образом в выделении достаточно! для анализа количества
определенных реплицирующихся молск;
ДНК. Это препятствие можно обойти, используя двумерны гель-
электрофорез, который позволяет разделить молекулы ДН по размеру в одном
направлении и по форме-в другом. Из-за тог что у реплицирующихся молекул
имеются разветвления, он мигрируют во втором направлении медленнее, чем
линейщ молекулы с той же массой. Разрезая реплицирующиеся молекул?,
рестриктазами, можно получить ряд различных разветвленщ/ форм, дающих в
двумерном геле характерное распределен^
(рис. 9.15).
Вы используете этот метод для изучения репликации плазмид
содержащей ARS1. Чтобы увеличить количество реплицирующв ся плазмидных
молекул, вы синхронизируете культуру дрожж и выделяете ДНК из клеток,
находящихся в S-фазе. Затем к обрабатываете ДНК ферментом Bglll или Pvul,
которые разр зают плазмиду, как показано на рис. 9-16, А. Вы разделяете
фра1 менты ДНК с помощью двумерного гель-электрофореза и посЬрнс. 9-16. С
блот-гибридизации с радиоактивно меченной плазмидной flHpVRSl (А) и
проводите радиоавтографию, чтобы можно было увидеть резулР^ель-электр тат
(рис. 9-16, Б). обработанн
А. Что представляет собой интенсивное пятно, возникшее в резу* и PvuI
Клеточное ядро 143
Рве. 9-15. Двумерный гель-электрофорез молекул с одним разветвлением
(А), симметрично расположенным репликационным глазком (Б), двумя
разветвлениями (В) и асимметрично расположенным реплика-ционным глазком
(Г) (задача 9-19). В верхней части рисунка изображены промежуточные
формы, образующиеся в процессе репликации условного фрагмента длиной 1
т.п.н. В нижней части рисунка показано, как такие интермедиаты процесса
репликации распределяются в геле.
А ОДНА ВИЛКА Б. СИММЕТРИЧНЫЙ В. ДВЕ ВИЛКИ
ГЛАЗОК
Г. АСИММЕТРИЧНЫЙ ГЛАЗОК
Первое направление (масса)
тате гибридизации и расположенное на обоих гелях в положении,
соответствующем 4,5 т.п.н. (рис. 9-16,?)?
Б. Доказывают ли результаты этого эксперимента, что ARS1 является
точкой начала репликации? Объясните ваш ответ.
В. На том геле, где разделяли материал, обработанный Pvul (рис. 9-16,
Б), в дугообразной линии зоны гибридизации имеется разрыв. В чем причина
