Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
этого?
9-20 Одно из основных правил репликации эукариотических ДНК состоит в
том, что ни одна хромосома или ее часть не может реплицироваться более
одного раза за клеточный цикл. Для того чтобы вирусы эукариот могли
образовать свои многочисленные копии за один клеточный цикл, они должны
обойти или изменить это правило. Например, вирус животных SV40 за один
цикл инфекции образует 100 ООО копий своего генома. Чтобы достичь этой
цели, вирус синтезирует специальный белок, называемый Т-антигеном (в
связи с тем, что сначала он был выявлен иммунологическими методами). Т-
антиген связывается с точкой начала репликации вируса SV40 и каким-то
образом инициирует синтез ДНК.
А. ПЛАЗМИДА
Б. РАЗДЕЛЕНИЕ В ГЕЛЕ ----------"• Первое направление
9-16. Строение плазмиды .RS1 (А) и результаты двумерного
^электрофореза этой плазмиды, работанной рестриктазами BglH Pvul (Б)
(задача 9-19).
144 Глава 9
Рис. 9-17. Типичный пример плазмиды, содержащей точку начала репликации
вируса SV40, после инкубации с Т-антигеном, белком, связывающимся с
одноцепочечными молекулами (SSB-белок) и АТР (задача 9-20).
Стадии развития яйца
СГ 1-8 10 12 13 14
Рис. 9-18. Блот-гибридизация гена белка хориона и контрольного гена на
разных стадиях развития яйца (задача 9-21).
Механизм, посредством которого
Т-антиген инициирует репликацию. изучали in vitro. Если в присутствии
очищенного Т-антиге-на, АТР и SSB (single-strand Ыпс1^)-белка,
связывающегося с одноцепочечной ДНК, инкубировать кольцевую плазмидную
ДНК, несущую точку начала репликации SV40, то с помощью электрон-i ного
микроскопа можно наблюдать частично расплетенные структуры (рис. 9-17).
Когда одного из этих компонентов нет, расплетенные структуры отсутствуют.
Расплетания не происходит и 4 том случае, если в точно такой же плазмиде
в точке начала репликации имеется делеция 6 нуклеотидов. При очень
осторож-; ном выделении, не допускающем появления одноцепочечных раз-|
рывов (т.е, когда выделена ковалентно-замкнутая кольцевая, ДНК), подобных
расплетенных структур не наблюдается, пока в инкубационную смесь не
добавлена топоизомераза I. |
A. Какой дополнительной активностью
кроме сайт-специфического связывания с ДНК должен обладать Т-антиген?
Какую роль может играть такая активность в инициации синтеза ДНК?
Б. Эти эксперименты показывают, что
структуры, наблюдаемые с по-1 мощью электронного микроскопа, расплетены в
области точки начала репликации вируса SV40. Положение этой точки в
геноме SV40 известно. Как с помощью рестриктаз доказать, что это*; именно
точка начала репликации, и определить, в одном или дву! направлениях
происходит расплетание этого участка?
B. Если плазмидная ДНК представляет
собой ковалентно замкнутое кольцо, то для чего нужна топоизомераза I?
(Топоизомераза
I вносит в двуспиральную ДНК
одноцепочечные разрывы и затем быстро их зашивает, так что разрывы
существуют лишь в течение очень короткого промежутка времени).
Г. Изобразите
структуру, которая могла бы получиться, если бы Т-антиген постоянно
индуцировал репликацию в точке начала репликации вируса SV40, встроенной
в геном.
9-21 Оболочка яйца дрозофилы состоит более чем из 15 различны! белков
хориона, которые синтезируются фолликулярными клетками, окружающими
яйцеклетку на поздних стадиях развития яйца, Гены белков хориона
сгруппированы в два кластера, один из которых расположен на 3-й
хромосоме, а другой-на Х-хромосоме,1 В каждом кластере гены расположены
близко друг к другу, и ш I разделяет расстояние всего лишь в несколько
сот пар нуклеотидов,: В ходе развития яйцеклетки число копий генов,
кодирующих белп: хориона, увеличивается благодаря дополнительной
репликацш сегмента хромосомы, в котором тот или иной ген расположен.
Подобную амплификацию можно обнаружить, если из яиц, находящихся на
разных стадиях развития, выделить ДНК, обработал ее рестриктазой и
провести блот-гибридизацию, используя в качестве зонда кДНК для белков
хориона. Как показано на рис. 9-18, число генов, кодирующих белки
хориона, постоянно увеличивается; между стадиями 8 и 12, а число копий
контрольного гена, не входящего в состав этого кластера, остается
постоянным. Уровень
о
Рис. 9-
в обла окруж; щих 6l
Рис. 9-',
ДНК II
ее в от
(задача
ченные
цикла.
после
Фракщ
("тяже.1
фракци
("легки
специф
вирусн;
щим м
перед i
сивном
товым
реплик:
10-1428
