Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
должен связываться с длинной одноцепочечной молекулой и двигаться вдоль
нее в направлении от 5'- к З'-концу, пока не достигнет двухцепочечного
района, образованного З'-полуфраг-ментом. Затем dnaB начинает
раскручивать этот фрагмент. Движение dnaB от 5'- к З'-концу предполагает,
что он расплетает родительский дуплекс в репликативной вилке, двигаясь
вдоль отстающей цепи.
Если dnaB движется в направлении от 5'- к З'-концу, то почему он
не плавит 5'-полуфрагмент субстрата 3, связываясь с коротким 5'-
"хвостом"? Не удивляет ли это вас? На самом деле в экспериментах
небольшое количество 5'-полуфрагмента выплавляется. Считается однако, что
плавление, обусловленное коротким 5'-"хво-стом", является неэффективным
из-за различия в размере мишени: гораздо более вероятно, что dnaB
связывается с длинной одноцепочечной структурой, а не с короткой.
B. Если SSB-белок добавляли первым, он ингибировал расплетание,
опосредованное dnaB, потому что обволакивал одноцепочечную ДНК,
препятствуя связыванию с ней dnaB. И наоборот, если SSB-белок добавляли
после того, как dnaB связался, он стимулировал расплетание, предохраняя
раскрученную молекулу ДНК от реассоциации.
Литература: LeBowitz, J. Н.\ McMacken, R. The Escherichia coli dnaB
replication protein is a DNA Helicase. J. Biol. Chem. 261, 4738 -4748,
1986.
5-27 Как всегда вы вышли победителем. Вначале вы были поставлены в тупик
разнообразием структур, но быстро обнаружили, что
Основные генетические механизмы 295
О
---------CZZZD-
с >
3 С
3-С- ----
Рис. 5-51. Двунаправленная репликация из одной точки начала репликации
(ответ 5-27).
Н-формы вполне похожи на глазки, за исключением того, что
расщепление происходило внутри глазка, а не снаружи. Затем вы поняли, что
переставляя молекулы в соответствии с увеличением размера глазка (и
подравнивая некоторые структуры до одинакового положения их концов),
можно представить убедительное наглядное доказательство двунаправленности
репликации от одной точки начала репликации (рис. 5.51). В итоге вы
объясняете коллегам, что этот эксперимент не позволяет определить
положение точки начала репликации, поскольку она могла происходить по
часовой стрелке или против нее от сайта рестрикции, в котором кольцо было
расщеплено. Вы планируете повторить эксперимент и использовать разные
ферменты рестрикции. Ваш руководитель доволен.
5-28
А. Во всех случаях, когда мутация затрагивает какой-либо один из
белков, необходимых для продвижения репликативной вилки, будет
проявляться "быстро останавливающийся" фенотип, потому что вилка не
способна продвигаться вперед без функционирования этих белков. Это
значит, что температурочувствительные мутанты по ДНК-топоизомеразе I (не
способные снимать скручивающее напряжение перед репликативной вилкой),
мутанты по белку, дестабилизирующему спираль (не способные
стабилизировать одноцепочечную ДНК в этой вилке), а также мутанты по ДНК-
ге-ликазе (не способные расплавлять ДНК впереди репликативной вилки) и
мутанты по РНК-праймазе будут проявлять "быстро останавливающийся"
фенотип. Трудно объяснить только фенотип мутанта по РНК-праймазе. Этот
фермент непосредственно затрагивает синтез отстающей цепи, но он не нужен
для синтеза ведущей цепи. У такого мутанта "быстро останавливающийся"
фенотип может возникать вследствие одного из двух косвенных эффектов: 1)
из-за доступности в достаточном количестве одноцепочечной ДНК, способной
связать весь запас белка, дестабилизирующего спираль, или 2) из-за
взаимодействия с ДНК-геликазой, которая связывается с РНК-праймазой как
частью праймосомы.
При мутациях в белках, не участвующих в продвижении репли-
кационной вилки, будет проявляться "медленно останавливающийся" фенотип.
Таким образом, мутация по температурочувствительному белку инициации
будет давать "медленно останавливающуюся" картину репликации, так как
молекулы ДНК, которые уже прошли ступень инициации, при повышении
температуры должны продолжать репликацию вдоль хромосомы, пока не
подойдет следующая ступень инициации. Подобным образом мутация по
температурочувствительной ДНК-лигазе даст "медленно останавливающийся"
фенотип, так как продвижение репликативной вилки вперед не будет
останавливаться полностью. Репликация прекратится только в следующем
цикле, когда начнут "обнажаться" надрезы на матричной цепи ДНК.
Б. Смешанные экстракты должны быть полностью компетентны в отношении
репликации ДНК при 42 °С, т.е. смесь должна обнаруживать немутантный
фенотип. Экстракты, дефектные по ДНК-геликазе, содержат нормальную ДНК-
лигазу, а экстракты, дефектные по ДНК-лигазе, обеспечивают нормальной
ДНК-геликазой. Таким образом, в смешанном экстракте должен быть
представлен весь комплемент нормальных белков. Эта взаимная коррекция
экстрактов с разными нехватками называется комплементацией. (Из-за
чрезвычайной сложности процесса репликации
ДНК и из-за большого числа участвующих в нем белков бесклеточ-ные
