Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
Ведущая ... . * ~\^()тстак>щая
3^-
Отстающая Ведущая (r)
Б. Четыре наблюдавшиеся чаще всего структуры, а также те структуры,
которые не были обнаружены, представлены на рис. 5-49. В какой-то мере
неожиданно то, что часто встречались структуры типа 1 и 3, у которых в
одной или обеих вилках нет одноцепочечной ДНК. Эти структуры могли
образоваться в результате сильно асинхронного роста в вилке (когда
ведущая цепь замедляется, пока запаздывающая цепь ее не догонит); с
другой стороны, они могут представлять собой артефакты, возникающие в
процессе изготовления препарата ДНК для электронно-микроскопического
исследования. Возможно и то, что одноцепочечные участки были слишком
короткими, чтобы их можно было отличить от двухцепочечной ДНК.
Литература: Inman, R. В.; Schnos, М. Structure of branch points in
replicating DNA: presence of single-stranded connections in lambda DNA
branch points. J. Mol. Biol. 56, 319-325, 1971.
5-24
A. Использование различных меток для Т- и С-нуклеотидов позволяет
проследить за процессом их удаления из полимера. Радиоактивный распад
изотопа 32Р, обладающего высокой энергией, можно легко отличить с помощью
сцинтилляционного счетчика от распада изотопа 3Н, обладающего довольно
низкой энергией. Измерение можно было сделать и при использовании одного
изотопа, хроматографически разделив отщепленные нуклеотиды, однако такая
процедура занимает гораздо больше времени.
Б. Вследствие того что по своей нуклеазной активности ДНК-поли-мераза
I является экзонуклеазой (т.е. она отщепляет нуклеотиды с концов цепей),
Т-нуклеотиды не могут быть отщеплены, пока не будут удалены все С-
нуклеотиды, из-за этого возникает задержка.
B. Если в реакционную смесь добавлен дезокситимидинтрифосфат (dTTP),
то сразу же, как только появляется соответствующая АТ-пара, начинается
полимеризация. От неправильно спаренной AC-пары полимеризация не может
начаться. Скорость полимеризации превышает на два-три порядка скорость
экзонуклеазной реакции, поэтому меченые Т-остатки будут быстро "исчезать"
с конца цепи, становясь недоступными для действия экзонуклеазы.
Г. Присутствие дезоксицитидинтрифосфата (dCTP) не будет влиять на
результаты. Поскольку матрицей служит poly(dA), С-нуклео-
А. НАБЛЮДАЕМЫЕ Б. НЕОБНАРУЖЕННЫЕ
% от общего СТРУКТУРЫ СТРУКТУРЫ
числа
наблюдаемых 1 2
форм
29
39
22
10
С
3
С
7
) с
) (
) (
)
294 Г лава 5
Требуемая
5 1 поел едовател ьность 3'
А т с С Т Т G С G Т т G А А А Т
Т с т т G т Т т G С т С С А G А
А т т с Т с Т т G т т т G С Т С
А С А т G с Т А G т т т Т А С G
А т т G А с А т G с т А G Т т Т
А т с Т Т с С т G т т т Т т G G
А А А т А т Т т G с т т А т А С
С Т А G А А С G G т т А С с С Т
5 4 3 2 1
3' Ф Ж Ж ж 5 -
Цепь ДНК РНК-затравка
Рис. 5-50. Стартовые сайты и сигнальная последовательность для РНК-
затравки (ответ 5-25).
тиды не могут включаться. Если такое событие все же произойдет по
ошибке, то неправильно спаренный С не будет служить праймером для
полимеризации.
Литература: Brutlag, DKornberg, A. Enzymatic synthesis of
deoxyribonucleic acid. 36. A proofreading function for the 3' to 5'
exonuclease activity in deoxyribonucleic acid polymerases. J. Biol. Chem.
247, 241-248, 1972.
5-25 Сравнение матричных последовательностей и последовательностей
продуктов рестрикции позволяет определить первые 5 нуклеотидов, с которых
начинаются цепи ДНК-продуктов, как показано на рис. 5-50. (Следует
помнить, что цепи ДНК идут антипараллельно друг другу.) Необходимая для
начала синтеза РНК матричная последовательность-это 5'-GPyT-3' (где Ру -
любое пиримидиновое основание). Молекулы РНК-затравки начинаются с
пуринового нуклеотида, противостоящего любому пиримидину в матрице.
Сравнение больших участков последовательностей позволяет предположить,
что для начала синтеза РНК нужны только три приведенных выше нуклеотида.
Литература: Cha.T.A.; Alberts, В. М. Studies of the DNA helicase-
RNA primase unit from bacteriophage T4. A trinucleotide sequence on the
DNA template starts RNA primer synthesis. J. Biol. Chem. 261, 7001-7010,
1986.
5-26
A. Гидролиз ATP необходим для расплетания спирали ДНК, потому что
плавление ДНК идет с затратой энергии. Разделение цепей энергетически
невыгодно из-за того, что на преодоление стекинг-взаимодействий между
плоскими гетероциклами спаренных оснований тратится много энергии. К тому
же водородные связи, которыми соединены основания каждой пары, создают
кинетический барьер для разделения цепей.
Б. Поскольку dnaB выплавляет только З'-полуфрагменты субстрата 3, он
