Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
результате были созданы такие методы, как иммуноанализ с поляризацией
флуорес-
520
Глава 33
ценции [9], лазерная нефелометрия [10], гомогенный иммуноферментный
анализ (фирма Syva Corporation), которые уже применяются в клинических
лабораториях. Однако все еще ощущается потребность в методе, пригодном
как для исследовательских, так и для рутинных целей. СВО-устройства
обеспечивают один из альтернативных подходов в гомогенном иммуноанализе,
причем к их преимуществам относится возможность использовать различные
оптические методы детектирования.
С точки зрения иммуноанализа ключевой характеристикой методов СВО
является способность непосредственно следить за ходом поверхностных
реакций без помех со стороны объема раствора. Основная идея метода
заключается в фиксации одного из компонентов иммунной пары на поверхности
волновода и контроле его реакции с комплементарным антигеном (или
антителом), причем нет необходимости в формальной стадии разделения,
поскольку происходит разделение in situ на поверхности волновода в
оптически чувствительной зоне затухающей волны. Таким образом удается
избежать стадии физического разделения связанных с антителами и свободных
молекул.
В следующих разделах рассмотрена теория некоторых оптических методов
контроля поверхностных реакций с помощью затухающей волны, генерируемой
при внутреннем отражении света; отмечены наиболее важные факторы, которые
необходимо учитывать при проектировании оптических систем с элементами
внутреннего отражения; дан обзор имеющейся литературы по применению СВО-
устройств в иммуноанализе, и, наконец, обсуждаются перспективы развития
этой области.
33.2. Теоретические аспекты
33.2.1. Принципы спектроскопии внутреннего отражения
Если граница раздела между двумя прозрачными средами освещается пучком
света (рис. 33.2), проходящим к границе через среды с более высоким
показателем преломле-
z
Ес
Е
Рис. 33.2. Генерация затухающей волны на границе раздела между двумя
оптическими средами, а: при п1 > п2 и 0 > вс, где 0С- критический угол
отражения, затухающая волна возникает на отражающей поверхности; б; то
же, что и а, но показана амплитуда электрического поля Е по обе стороны
отражающей поверхности при генерации затухающей волны (z - расстояние от
отражающей поверхности в глубь менее плотной оптической среды; d -
характерная глубина проникновения затухающей волны в эту среду).
Спектроскопия внутреннего отражения
521
ния (/;, > п2) под углом 0, и если 0 больше критического значения 0С:
0С = sin ~1(п2/п1),
(33.1)
то имеет место полное внутреннее отражение.
В этом случае затухающая волна проходит через отражающую поверхность в
оптически менее плотную среду на расстояние dp, имеющее тот же порядок,
что и длина волны падающего света. В соответствии с уравнениями Максвелла
в более плотной среде возникает стоячая синусоидальная волна,
перпендикулярная отражающей поверхности (рис. 33.1,6), Хотя поток энергии
в непоглощающую свет оптически менее плотную среду отсутствует, в этой
среде имеется затухающее электромагнитное поле. Вследствие условия
непрерывности поля амплитуда вектора электрического поля (?) имеет
наибольшее значение на границе раздела фаз (Е0) и экспоненциально спадает
при удалении от нее на расстояние (Z):
Глубина проникновения dp определяется как расстояние от поверхности, на
котором амплитуда электрического поля уменьшается в е раз от значения на
поверхности, и задается выражением
Отсюда видно, что величина dp уменьшается с ростом 0 и увеличивается по
мере сближения показателей преломления (т.е. при nJn2-+\). Кроме того,
поскольку с/р пропорциональна длине волны, dp тем больше, чем больше
длина световой волны.
Таким образом, путем тщательного выбора показателя преломления ЭВО п2,
угла падения и длины волны света можно подобрать такое значение dp, чтобы
усилить взаимодействие света с соединениями, близко расположенными или
фиксированными на границе раздела фаз, и свести к минимуму его
взаимодействия с объемом растворов.
В качестве примера рассмотрим кварцевый волновод (/?л = 1,46),
находящийся в контакте с оптически менее плотной водной средой (п2 =
1,34). Для этой системы 0С равно 66° (см. уравнение (33.1)). В
соответствии с (33.3) при 0 = 70° и X = 500 нм глубина проникновения
света в раствор dp составляет приблизительно 270 нм. Оценка размеров
молекулы IgG (антитела) дает приблизительно 10 нм х 6 нм [1]. Таким
образом, образующийся на поверхности иммунный комплекс сандвич-типа из
трех слоев IgG имеет средний диаметр около 25 нм. На таком расстоянии
напряженность поля еще составляет 91% Е0 (см. уравнение (33.2)). Однако
при удвоении или утроении этого расстояния напряженность поля
экспоненциально падает соответственно до 83 и 76%.
Глубина проникновения является одним из четырех факторов, определяющих
ослабление сигнала поглощающей пленкой при внутреннем отражении.
Остальные три фактора-это поляризация, зависящая от напряженности
