Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
электрического поля на отражающей границе раздела фаз; площадь зоны
детектирования, которая увеличивается с ростом 0; согласование
показателей преломления оптически более и менее плотных сред, что в свою
очередь контролирует степень их оптического сопряжения. Все эти факторы
учитываются в эффективной толщине t/e, которая соответствует фактической
толщине пленки, демонстрирующей такое же поглощение в эксперименте с
пропусканием света.
Для повышения чувствительности часто используют элементы многократного
отражения. Число отражений (N) является функцией длины (L) и толщины (Т)
волновода и угла падения (0):
Е= Е0 exp (- Z/dp).
(33.2)
l/7?i
(33.3)
2 П [sin2 0 - (h2/wi)2]1/2 '
N = Ы Т- ctg0.
(33.4)
522
Глава 33
Чем длиннее и тоньше волновод, тем больше N и тем чаще
затухающая волна
взаимодействует с поверхностным слоем, содержащим комплекс
антитело-антиген.
Если при однократном отражении коэффициент отражения R равен
R=l-adc, (33.5)
где а - коэффициент поглощения и ^-эффективная толщина слабо поглощающего
слоя, то после N отражений коэффициент отражения падает до
RN =l-Nade. (33.6)
Затухающую волну используют для контроля поверхностных реакций в
сочетании с несколькими оптическими методами. Особо отметим два основных
способа оптического детектирования. Первый основан на поглощении света
или флуоресценции определяемым веществом-это, например, НПВО и НПВОФ.
Системы второго типа основаны на описываемом ниже эффекте поверхностного
плазмонного резонанса, который обусловлен зависимостью показателя
преломления тонких пленок, например иммунохимических, от толщины.
32.2.2. Нарушенное полное внутреннее отражение и нарушенное полное
внутреннее отражение с флуоресценцией
При контакте поглощающего материала с отражающей поверхностью ЭВО
получающийся внутренне отраженный пучок света, как уже говорилось,
ослабляется [16]. В методе НПВО измеряют ослабление отраженного света как
функцию его длины волны. В спектроскопии НПВОФ используют флуоресцирующие
вещества и, таким образом, поглощенная энергия частично вновь излучается
в виде флуоресцентного света, который и детектируется.
Для измерения флуоресценции на границе раздела волновод/жидкость можно
использовать различные методы регистрации и обработки сигналов.
Флуоресценцию на границе раздела фаз можно детектировать либо обычным
способом, располагая детектор под прямым углом к поверхности (на рис.
33.1, б-справа), либо по ходу основного пучка (рис. 33.1, г). Поскольку
при детектировании по ходу основного пучка телесный угол излучения света
мал по сравнению с регистрацией под прямым углом, первый способ, казалось
бы, менее эффективен. Однако существует эффект усиления, и теория
предсказывает, что для волновода из плавленого кварца, контактирующего с
водной средой (п2). интенсивность флуоресценции по ходу основного пучка
может быть в 50 раз выше, чем интенсивность флуоресцентного света,
излученного под прямым углом к отражающей поверхности. Этот эффект -
туннелирование флуоресцентного света обратно в волновод - подтвержден как
теоретически, так и экспериментально [6, 26].
На словах его можно объяснить следующим образом. Падающая плоская волна
генерирует затухающую волну, которая возбуждает молекулы вблизи
поверхности, причем число возбужденных молекул пропорционально
интенсивности электрического поля затухающей волны (см. уравнение 33.2).
По истечении характеристического времени жизни в возбужденном состоянии
эти молекулы испускают флуоресцентное излучение. Локальное распределение
интенсивности флуоресценции вблизи поверхности весьма сходно с
описываемым уравнением (33.2) распределением числа возбужденных молекул,
т. е. теперь вместо затухающего исходного света мы имеем дело с
затухающей флуоресценцией. На вопрос о том, что случится с затухающей
флуоресцентной волной, можно ответить, воспользовавшись принципом
оптической обратимости, который гласит, что излучаемый при флуоресценции
свет возвращается в волновод в виде плоской волны так же, как в первичном
процессе генерации затухающей волны исходным плоскополяризованным светом.
Согласно теории, интенсивность флуоресцентного излучения достигает
пикового значения при критическом
Спектроскопия внутреннего отражения
523
угле полного внутреннего отражения, так что может произойти его полное
внутреннее отражение. Для повышения чувствительности ЭВО следует
конструировать таким образом, чтобы можно было собирать флуоресцентное
излучение после нескольких отражений и уже затем направлять в детектор.
Этот способ особенно выгоден, если в качестве ЭВО используют оптическое
волокно, поскольку довольно трудно направить к детектору все испускаемое
под прямым углом флуоресцентное излучение вытянутого в длину волокна.
Детектирование по ходу отраженного пучка позволяет также измерять
флуоресцентный свет, не прошедший через объем раствора вокруг волокна; в
противном случае раствор может оказывать мешающее влияние (в зависимости
