Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
антигены небелковой природы. Для этого используют химические реакции,
пригодные лишь для определенных соединений, поэтому здесь мы их также не
будем обсуждать. Отметим, однако, один из подходов к решению данной
проблемы, состоящей в том, что на ЭВО наносят белок (например, бычий
сывороточный альбумин), с которым затем связывают его небелковый антиген
[24].
Наиболее распространенными методами иммобилизации белка на кварцевых или
стеклянных поверхностях являются физическая адсорбция и ковалентное
связывание. По данному вопросу имеется значительное количество информации
(см., например, обзоры [20], [34], [53-55]) и для подробного ознакомления
отсылаем читателя к этим обзорам, а в этой главе ограничимся
рассмотрением общих принципов.
Физическая адсорбция белков на кремнийсодержащих поверхностях является,
вероятно, результатом слабых взаимодействий, таких как заряд-зарядовое
(например, ионное, образование солевых мостиков), или образования
водородных связей [33]. Однако образуемые при адсорбции связи между
белком и стеклом столь прочны, что для удаления белков требуются сильные
кислоты или щелочи. Привлекательность физической адсорбции при создании
ЭВО, покрытых антителами, обусловлена возможностью быстрой адсорбции
белков на стеклянных поверхностях в одну стадию. Кроме
Спектроскопия внутреннего отражения
529
того, адсорбция не приводит к изменению оптических характеристик стекла.
Типичная методика иммобилизации антител на стекле или кварце заключается
в следующем. Сначала поверхность очищают, используя сильные кислоты,
детергенты, органические растворители или комбинации этих реагентов, а
также физические методы (например, нагревание до высоких температур или
ионную бомбардировку [5, 48]). Далее поверхность гидрофобизируют
(например, окуная ЭВО в дихлорметилсилан [12]), что способствует
адсорбции белка. Затем ЭВО погружают на несколько часов в раствор
соответствующего белка, промывают, чтобы удалить несвязанный белок,
инкубируют в растворе неспецифического белка для блокировки незаполненных
центров связывания, опять промывают и до использования хранят в сухом
виде при 4°С.
Адсорбция белков на поверхностях твердых тел- это сложный и, вообще
говоря, плохо изученный процесс [30]. Поэтому и получение волноводов,
покрытых антителами, базируется на эмпирическом методе проб и ошибок.
Кроме того, используя этот метод, трудно предсказать конфигурацию белков
на поверхности и влияние самой адсорбции на доступность центров
связывания антител для антигенов. В этом смысле ковалентное связывание
более привлекательно, поскольку в принципе оно позволяет контролировать
процесс иммобилизации и до определенной степени предсказывать результат.
Большинство работ по ковалентному связыванию белков с кремнийсодержащими
поверхностями выполнено на стеклянных частицах с контролируемыми
размерами пор [31]. Наиболее распространенным и, вероятно, простейшим
методом является реакция белка с силановыми связывающими агентами. Эти
агенты представляют собой мономерные силаны, имеющие на одном конце
органические функциональные группы, а на другом-группы, реагирующие с
неорганической поверхностью. Типичным таким агентом является у-
аминопропилтриэтоксисилан (АПТС), который можно использовать для
присоединения белка к кремнийсодержащей поверхности с помощью следующей
трехстадийной процедуры. В кислых водных растворах эфирные группы АПТС
гидролизуются с образованием гидроксилов, которые могут затем
взаимодействовать с поверхностными силанольиыми группами. В результате
получается поверхность с боковыми цепями, содержащими аминогруппу:
(Si02)" - SiOH + С2Н5 -OSi(OC2H5)2(CH2)3 -NH2 -" (33.7)
(Si02)" SiOSi (OC2H5)2 (CH2)3 NH2.
На второй стадии аминогруппы используют для получения активного
промежуточного соединения - альдегида - по реакции с глутаровым
альдегидом в нейтральной среде:
(Si02)"-NH2 + ОСН (СН2)2 СНО -> (Si02)"-N=CH(CH2)2 СНО. (33.8)
Последняя стадия заключается в реакции альдегидной группы с первичным
амином белка с образованием иминной связи:
(Si02)"-СНО + NH2-антитело ->(Si02)"-CH=N-антитело. (33.9)
Этот метод используют для иммобилизации антител на плоских кварцевых ЭВО
и оптических волокнах [46, 47]. В нем, однако, имеется ряд подводных
камней. В частности, оптимальные концентрации активных альдегидных групп
на поверхности попадают в довольно узкий диапазон. Для получения
устойчивого слоя антител на поверхности ЭВО требуется, чтобы число таких
групп было минимальным - если их слишком много, это может приводить к
многоточечному связыванию антител на поверхности и падению их
иммунохимической активности. Кроме того, толщина силанового слоя зависит
от многих факторов, включая pH, температуру, продолжительность химической
реакции, удельную поверхность, концентрацию силана и приро-
34- 1145
530
Глава 33
ду растворителя [44]. Чтобы добиться воспроизводимости при оптимизации
условий иммобилизации антител, необходимо учитывать все эти факторы.
