Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
некоторой степени зависит от количества аналога анализируемого вещества
[А*]общ в сенсоре. Практически допустимая минимальная концентрация
лиганда-аналога в сенсоре зависит от способности оптической системы
регистрировать слабую флуоресценцию и от возможного присутствия мешающих
веществ, например билирубина, в крови.
Из уравнения (32.17) видно, что нормированный сигнал является функцией
двух комбинаций параметров: [R]o6ni/[A*]o6lIl и (Ка[А] + 1)/([А*]о6щ•
К*). Последняя комбинация содержит независимую переменную, концентрацию
определяемого вещества [А], которая и представляет основной интерес.
Таким образом, безразмерный график зависимости [А*]/[А*]общ от (К.Л [А] +
1)/([А*]о6щ К*) полностью характеризует систему (рис. 32.8).
Из рис. 32.8 видно, что при низких значениях [R]o6lu/[A *]общ сенсор
слабо реагирует на изменение концентрации определяемого вещества.
Физически это условие отвечает ситуации, когда концентрация аналога так
велика по сравнению с количеством рецептора, что несвязанный аналог
присутствует в большом избытке. Поэтому дополнительное вытеснение
лиганда-аналога с рецепторных центров определяемым веществом почти не
влияет на концентрацию свободного аналога. Отсюда ясно, что у биосенсоров
этого типа можно получить хорошую градуировочную кривую в представляющем
интерес диапазоне концентраций, лишь если [R]o6ui/[A *]обш" 1-
Тот же принцип можно рассмотреть и с другой точки зрения. Для удобства
работы желательно, чтобы сигнал был малым при малых концентрациях
определяемого вещества и большим при максимальных концентрациях,
ожидаемых в каждом конкретном случае. Этому условию отвечает значение
величины [К]о6щ/[А*]о6щ порядка 10. С другой стороны, при более высоких
значениях [R]o6lu/[A*]o6iu (порядка 100) возможны другие проблемы,
связанные с тем, что реальная концентрация аналога определяемого вещества
может оказаться слишком низкой для детектирования оптической системой.
Следуя этим рассуждениям, можно оценить значения физико-химических
констант, необходимые для какого-либо конкретного приложения сенсора. Во-
первых, желательно, чтобы при концентрации определяемого вещества, равной
нулю, выходной сигнал сенсора был мал. Подставляя значения [А] = 0,
[R]o6ul/[A*]o6lu = 10 и минимальное значение отклика сенсора [А*]/[А*]общ
= 0,1, из уравнения (32.17) находим, что член [А*]о6щК* должен быть
порядка 1,0.
Тогда, чтобы при концентрации определяемого вещества в середине
исследуемого диапазона [А'] сигнал был на уровне 50% максимального
значения, произведение К.Л [А'] должно быть порядка 10, если [А*]/[А*]общ
положить равным 0,5. Рассмотрим, к примеру, глюкозный сенсор. У больных
диабетом концентрация глюкозы составляет 1-5 мг/мл и, таким образом, [А']
равно 5 мг/мл или ~ 0,025 М. Константа связывания глюкозы с Con A (KJ
составляет около 320 М-1. Максимальное количество Соп А, которое можно
иммобилизовать на внутренней поверхности полой диализной трубки,
эквивалентно эффективной концентрации 10"5 М. Константа связывания FITC-
декстрана (молекулярная масса 70000) с Соп А составляет около 7,5-104 М1,
а общая концентрация меченого декстрана в сенсоре около 1,5 ¦ 10_б М.
Отсюда при концентрации глюкозы 2,5 мг/мл значение величин Ка[А'] и
[Р]"бш[А*]общ составляют соответственно 6 и 7, т.е. попадают в
приведенные выше диапазоны значений для этих критериев.
Приведенные рассуждения позволяют сформулировать следующие правила
конструирования биосенсора.
1. Оцените среднюю концентрацию определяемого вещества [А'].
2. Выберите биорецептор с численным значением константы связывания
порядка Ю/[А'].
33:
516
Глава 32
3. Оцените минимальную концентрацию лиганда-аналога, детектируемого
оптической системой [А]га. Желательно, чтобы величина [А*]общ была
порядка 50 [А]т.
4. Выберите, синтезируйте или модифицируйте такой конкурентный аналог
определяемого вещества, чтобы удовлетворялся критерий Kf = l/[A]m.
5. Разработайте методику заполнения рабочей камеры сенсора биорецептором
в таком количестве, чтобы суммарная концентрация центров связывания была
порядка 100 [А*]общ.
32.4.3. Сенсоры с многовалентным связыванием
До сих пор мы ограничивали обсуждение системами, в которых взаимодействие
лигандов и рецепторов описывается моновалентными реакциями. Фактически,
однако, большинство антител по меньшей мере двухвалентны (т.е. имеют два
рецепторных центра), а многие и поливалентны. Конканавалин А имеет,
например, четыре рецепторных центра. Точно так же и гаптены (аналоги
определяемых веществ) обычно содержат несколько активных групп. Таким
образом, приведенные выше простые модели неверны для этих более сложных
систем. Общая математическая теория таких систем пока еще только
разрабатывается [15]. Однако в первом приближении для оценки свойств
биосенсора можно использовать описанный выше подход с псевдомоновалент-
ными константами связывания. Например, как уже отмечалось, константа
связывания глюкозы с Соп А составляет около 320 М-1, тогда как для FITC-
