Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Тёрнер Э. -> "Биосенсоры: основы и приложения" -> 298

Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.

Тёрнер Э., Карубе И., Уилсон Дж. Биосенсоры: основы и приложения — М.: Мир, 1992. — 614 c.
Скачать (прямая ссылка): biosensoriosnoviiprilojeniya1992.djvu
Предыдущая << 1 .. 292 293 294 295 296 297 < 298 > 299 300 301 302 303 304 .. 355 >> Следующая

В устройствах для СВО используют и ряд других систем с ковалентным
связыванием [36]. Так, иммобилизацию белка на поверхности кремниевых
пластинок проводят следующим образом. Кремниевые пластинки алкилируют,
после чего образованные на алкилированной поверхности гидроксильные
группы активируют трезилхлоридом. Трезилатные группы могут затем
реагировать с аминогруппами белка. Этот метод применяли для закрепления
на кремниевых поверхностях конканавалина А, который в дальнейшем
реагировал с клетками S. aureus. Взаимодействие клеток с поверхностью
контролировали с помощью эллипсометрии [32].
33.4. Применение СВО-приборов в иммуноанализе
33.4.1. Нарушенное полное внутреннее отражение
В иммуноанализе используют спектроскопию НПВО в ИК-, видимой и УФ-обла-
стях спектра. Как уже отмечалось выше при рассмотрении принципов НПВО,
захват антигена (или антитела) на границе раздела волновод/жидкость
регистрируется как ослабление светового пучка при внутреннем отражении.
Это ослабление зависит от положения максимума поглощения одного из
компонентов иммунохимической пары.
В работе [38] НПВО использовали для мониторинга в ИК-области реакций
между различными сывороточными альбуминами и соответствующими
антисыворотками на границе раздела германий/раствор. Сначала поверхность
волновода погружали в раствор антигена и регистрировали спектр
пропускания адсорбированного белкового слоя. В последующей реакции с
разбавленным раствором антисыворогки связывание антител идентифицировали
по уменьшению пропускания света в области, характерной для амидогрупп
(1650 см-1). При специфическом связывании, т.е. при протекании реакции
антитело - антиген, изменение оптической плотности составляло 0,032, а
при неспецифическом связывании (в отсутствие антигена) - только 0,007.
Хотя рассмотренный подход оказался вполне успешным, в нем все же далеко
не полностью реализуются потенциальные возможности методов СВО, которые в
принципе позволяют непрерывно контролировать иммунохимические реакции как
в видимой, так и в УФ-области.
В качестве модельной системы для мониторинга методом НПВО использовали
реакцию между гемоглобином и антигемоглобиновой антисывороткой кролика
(Sutherland R. М., Kulhanek Е., Dahne С., неопубликованные данные). В
этом случае антитела кролика, ковалентно иммобилизованные на поверхности
кварцевого предметного стекла, реагировали с растворами гемоглобина
разной концентрации. Измеряя ослабление отраженного света на длине волны
410 нм (максимум поглощения гемоглобина), получили кривую изменения
интенсивности сигнала во времени, на которой можно выделить три участка
(рис. 33.8). Исходную базовую линию устанавливали по физиологическому
раствору, содержащему овечью сыворотку (чтобы минимизировать
нсспецифическое связывание гемоглобина с поверхностью). При введении в
систему раствора антигена пропускание резко падает вследствие поглощения
света молекулами гемоглобина, диффундирующими на глубину проникновения
затухающей волны. Затем следует быстрое ослабление пропускания по мере
связывания молекул гемоглобина с антителами вблизи поверхности. Наконец,
когда центры связывания антител насыщаются, скорость изменения
пропускания снижается. На рис. 33.8 показаны также результаты повторных
опытов с вытеснением антител с поверхности пластинки бычьим сывороточным
альбумином. Разница между двумя кривыми характеризует специфическое
связывание гемоглобина с поверхностью.
Спектроскопия внутреннего отражения
531
Рис. 33.8. Взаимодействие гемоглобина с антигемоглобином кролика (кодовый
номер А118, фирма Dako Immunoglobulins. Копенгаген, Дания),
присоединенным к поверхности элемента многократного отражения с помощью
ковалентных связей (сшивание аминопро-пилтриэтоксисиланом; подробности
см. в тексте) (I), и бычьим сывороточным альбумином, иммобилизованным
аналогично на втором ЭВО (2). В проточную ячейку, изображенную на рис.
33.6, вводили раствор гемоглобина концентрации 10 мг/мл. За реакцией
следили по ослаблению внутренне отраженного пучка света с длиной волны
410 нм. Разность между двумя кривыми (Z) характеризует специфическое
связывание (Sutherland R.M., Kulha-nek Е., Dahne С., неопубликованные
данные).
Время, мин
Аналогичные результаты были получены в работе [46], в которой за
специфическим связыванием хемотерапевтического средства метотрексата с
антителами, иммобилизованными на границе раздела кварц/раствор, следили
по ослаблению пропускания в УФ-области при 310 нм. Измеряя абсолютные
величины или скорости изменения пропускания, строили кривую сигнал доза.
Найденный по этой кривой предел обнаружения метотрексата этим методом
составляет 0,3 мкмоль/л.
33.4.2. Нарушенное полное внутреннее отражение с флуоресценцией
Впервые НПВОФ использовали для изучения иммунохимических реакций в
работах [23-25]. На поверхности кварцевого предметного стекла через
гаптен-альбуминовые конъюгаты иммобилизовали такие гаптены, как
фениларсоповая кислота или морфин. Связанные с гаптенами FITC-мечеиные
Предыдущая << 1 .. 292 293 294 295 296 297 < 298 > 299 300 301 302 303 304 .. 355 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed