Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
связывании стероида с антителом
Более фундаментальное исследование продемонстрировало недавно возможности
еще одного важного метода [5, 38], в котором используется перенос
исходного электронного возбуждения хемилюминофора к акцептору энергии
флуоресценции. Такое явление хорошо известно в спектроскопии и фотохимии
[26].
Лиганд (например, сАМР или прогестерон) ковалентно связывают с хемилюми-
несцирующим соединением (ABEI), а антитело делают флуоресцирующим,
присоединяя к нему флуоресцеин. Перенос энергии определяется уравнением
Ферстера, которое предполагает сближение донора и акцептора на близкое
расстояние (около 50 А) [26]. Таким образом, связанный изолюминол
излучает зеленый свет, а свободный сохраняет характерное для него голубое
свечение. В данной системе можно использовать различные фильтры (полосы
излучения достаточно широки), но лучшие результаты получаются при
соотношении 460/525 нм. Принцип данного метода заключается в следующем.
Антиген (Ag) метят хемилюминесцирующим соединением (С), а антитело (АЬ) -
флуоресцентным акцептором (F). При вытеснении Ag-С определяемым веществом
(в данном случае антигеном Ag (и)) неизвестной концентрации расстояние
между С и F становится слишком большим для переноса энергии, так что
связанный и свободный антиген легко различимы.
31.3.3. Методика измерения света
Хемилюминесцентные реакции могут разными способами реагировать на такие
факторы, как pH или наличие катализатора. Некоторые хемилюминесцентные
системы дают вспышку длительностью в миллисекунды либо более слабое
излучение, длящееся несколько часов. Био люминесцентными реакциями
управлять труднее, но и в этом
[22, 45].
свет (525 нм)
Ag (и)
Ag = = = -('<)
свет (460 вж)
Применение био- и хемилюминесценции в биосепсорах
499
Рис. 31.1. а: Измерение начальной интенсивности сигнала 10 обеспечивает
максимальную чувствительность, но дает меньшую, хотя и приемлемую
воспроизводимость.
6: Приборы, регистрирующие интенсивность пика сигнала, обеспечивают,
автоматическое количественное измерение. Пикового значения сигнала /тах
можно достигать, варьируя параметры реакции так, чтобы оптимальная
чувствительность сочеталась с воспроизводимостью, в: Приборы, аналогичные
используемым в (б), могут интегрировать сигнал начиная с любое., момента
и в течение заданного промежутка времени. С другой стороны, световой
сигнал можно интегрировать так долго, как необходимо, чтобы
обеспечивалась требуемая чувствительность.
случае достижимы аналогичные характеристики. Таким образом, процесс
детектирования может быть организован так, чтобы обеспечить максимум
чувствительности или удобства. При заданном числе фотонов
чувствительность, очевидно, максимальна, если свет излучается в возможно
кратчайшее время. Это имеет свои недостатки, поскольку погрешности,
связанные со смешиванием, становятся наибольшими на начальных стадиях
процесса люминесценции. Оборот фермента (как, например, в пе-роксидазных
реакциях) приводит к усилению хемилюминесценции, что выражается в
длительности и относительно более высокой интенсивности излучения,
поскольку люминесцирующее соединение имеется в избытке и связано
стехиометрическим соотношением с определяемым веществом. При
детектировании возможны также регистрация пиковой интенсивности сигнала,
его интегрирование и непрерывный контроль измерения скорости реакции.
Схематически эти возможности показаны на рис. 31.1.
31.3.4. Кинетические измерения
Скорости всех люминесцентных реакций сильно зависят от различных
факторов. Это потенциально мощное средство анализа, поскольку высокая
чувствительность измерительной аппаратуры к свету позволяет анализировать
малые порции раствора, быстро отбираемые в ходе протекания реакции.
31.3.5. Светоизмерительные приборы
Наиболее чувствительным и распространенным детектором света является
фотоумножитель. Связанная с ним электронная аппаратура достаточно хорошо
разработана, и в литературе [1] описаны основные светочувствительные
системы, которые нетрудно собрать. Современные счетчики фотонов
(импульсов) имеют повышенную чувствительность за счет снижения уровня
шумов и все шире используются в серийно выпускаемых люминометрах.
Вакуумные фотоумножители почти не создают шума в голубой области спектра
(340-450 мм) и являются, таким образом, вполне подходящими, если не
идеальными, детекторами для подавляющего большинства хемилю-минесцентных
реакций. Исключением является разве что система светляка, у которой пик
излучения приходится на более длинноволновую область (560 нм). Очень
прочные,
32"
500
Глива 31
дешевые и легко адаптируемые фотодиоды менее чувствительны, чем вакуумные
фотоумножители, особенно в голубой области спектра. Можно также
использовать современную фотопленку с повышенной чувствительностью.
Достоинства каждого из этих подходов обсуждаются в работе [6]. В
благоприятных случаях, когда свет достаточно интенсивен, можно
использовать недорогие портативные приборы на основе фотодиодных систем.
