Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
со2 + со2
Наконец, следует упомянуть диоксаэтаны 10 и 11, которые при умеренном
нагревании дают свет без участия каких-либо других реагентов или
промежуточных продуктов [58]. Простые диоксаэтаны, например 10, дают
почти исключительно триплетные состояния, тогда как более сложные
соединения типа 11 дают высокий выход синглетных состояний.
о-о I I
Н,С-С-С-CHj I I CHjCHj 10
нагревание
(СН3)2СО+(СНз)2СО
Me2N
0-0
\\ ^осЛ /
NMe2
1
Применение био- и хемилюминесценции в биосенсорах 497
31.3.2. Хе милю мине сцентный иммуноанализ
Преимущество использования биолюминесцентных систем в биоанализе
заключается в свойственной им высокой специфичности, поскольку люциферазы
и родственные им ферменты специфичны по своей природе. Если, однако, в
антитело или антиген (а иногда и в то и в другое) ввести
хемилюминесцирующую метку, то объединяются все достоинства ферментного и
радиоиммуноанализа без каких-либо нежелательных побочных эффектов. При
этом чувствительность может быть выше, чем в радиоиммуноанализе [56],
метка исключительно устойчива, измерения проводятся достаточно гибко и
легко, используется несложное и относительно недорогое оборудование [23,
24].
31.3.2.1. Методики хемилюминесцентного иммуноанализа. Хотя
хемилюминесцент-ный иммуноанализ возник совсем недавно, к настоящему
времени разработано несколько типов таких методов. Простейший из них
заключается в непосредственном вытеснении 1251 люминесцирующим
соединением. Описано много вариантов этого метода, в которых для мечения
гаптенов или небольших пептидов используют циклические гидразиды,
например изолюминол [46], сам люминол [28], акридиниевые эфиры [55].
диоксаэтаны [60].
Методы введения метки весьма сходны с методами присоединения
флуоресцирующих соединений к белкам или тирозина (для последующего
иодирования) к гаптенам. Во всех случаях используют изотиоцианат, N-
гидроксисукцинимидиловый эфир и амидоэфиры. Наиболее удобной меткой,
впервые примененной в работе [46] в 1978 г., является 6-[М-(4-
аминобутил)-М-этил]амино-2,3-дигидро-1,4-фталазин-1,4-дион (ABEI). Это
соединение и другие гидразиды использовали для мечения тироксина.
Аналогично были разработаны различные методы анализа стероидов [22, 45].
В этих методах при введении реагентов возникает легко измеряемая, хотя и
короткая, вспышка света. Отличные результаты достигнуты в количественном
определении белковых и пептидных гормонов, таких как hCG (гонадотропин
человека) [22], TSH (тиротропин) [56] и а-фетопротеин [55]. Для этих
целей лучше других пригодны соли акридиния.
Как уже отмечалось, реакции, в которых излучается детектируемый свет,
обычно протекают быстро. Это обеспечивает повышение чувствительности, но,
с другой стороны, при введении фермента в качестве метки в антиген или
антитела время излучения может существенно увеличиваться и в принципе это
можно было бы использовать для непрерывного мониторинга. Из систем такого
типа наиболее хорошо изучена пероксидаза в сочетании с люминол ом. К
примеру, пероксидазу хрена сопрягают со всеми компонентами, необходимыми
для полного анализа функции щитовидной железы, включая как белки, так и
гаптены. Несмотря на определенные успехи, такие методы еще находятся в
стадии становления и можно ожидать их дальнейшего усовершенствования (как
было показано на примере улучшения чувствительности при синергизме [60]).
Ситуация здесь сходна с тем, как развивался широко известный сейчас
иммуноферментный анализ, но обсуждаемый метод имеет еще два очень важных
для биосенсоров преимущества. Во-первых, световой поток прямо
пропорционален концентрации определяемого вещества (нет нарастания
интенсивности сигнала, как в фотометрическом анализе), во-вторых,
детектирование существенно проще.
32-1145
498
Глава 31
31.3.2.2. Гомогенный анализ. Все описанные выше методы анализа
предполагают отдельные измерения. Для непрерывного мониторинга
биологически важных соединений с помощью биосенсоров необходимо, чтобы
сигнал был непрерывным и непосредственно зависел от изменяющейся
концентрации анализируемого вещества, не требуя предварительного
разделения пробы. Недавно на основе двух совершенно различных явлений
были разработаны гомогенные методы иммуноанализа.
Существенным требованием в этих методах является, конечно, отличие
связанного лиганда от свободного, а влияние белка на свойства лиганда-
это именно то свойство, которым обладает люминесценция в отличие от
радиоактивности. При биолюминесценции свечение люциферина (длина волны и
интенсивность) как in vivo , так и in vitro сильно зависит от связывания
люциферина с белками или влияния растворителя в неводной среде [13, 32,
34, 53].
Эти эффекты используют в модельной биотин-авидиновой системе, в которой
при связывании интенсивность света, излучаемого люминольной меткой,
возрастает в 10 раз. В нескольких методах гомогенного анализа стероидов
используют дополнительное усиление света изолюминольной метки при
