Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
она не имеет прямого отношения к обсуждаемой здесь проблеме. В принципе
она аналогична хемилюминесцентным системам, которые будут рассмотрены
ниже.
Общая эффективность этого процесса, оцениваемая квантовым выходом (см.
ниже), исключительно высока и составляет 88% [48].
о-о
31.2.2. Использование люциферазы светляка для определения АТР
Поскольку АТР занимает центральное место в биохимии всех живых систем,
неудивительно, что имеется большое число работ (более 1000 статей),
посвященных его использованию. Описывать все эти приложения не имеет
смысла, тем более, что в работах [10, 24] обобщен накопленный в данной
области обширный материал и рассмотрены различные методы с применением
АТР. К последним относятся методы определения биомассы, обнаружения
бактериальных инфекций (не специфических к различным веществам),
определение антибиотиков и любые ферментативные реакции, в ходе которых
образуется или потребляется АТР.
Хотя требуемые для таких анализов материалы можно получать специально
[10], очень удобно использовать для этой цели высококачественные
коммерческие реактивы (например, фирм Sigma, США, или LKB-Wallac, Турку,
Финляндия).
Хотя АТР и является специфической мишенью, исторически важный метод
определения АТР с помощью люциферазы не пригоден для биосенсорных
приложений из-за его сложности. С помощью описываемых ниже гораздо более
гибких хемилюми-несцентных систем гораздо легче достичь высокой
чувствительности. Тем не менее довольно успешно используют люциферазу,
иммобилизованную совместно с другими аналитически важными ферментами
[11]. Этот метод позволяет определять на уровне 1 фмоль клинически важный
(при заболеваниях сердца) фермент креатинкиназу. Если же еще добавить
автоматизированные проточные системы, то можно получить довольно
практичные сенсорные устройства [25, 59].
Применение био- и хеминюминесценции в биосенсорах
491
31.2.3. Люминесценция бактерий
Светящиеся бактерии (например, Photobacterium phosphoreum, Vibrio
harveyi) найдены почти во всех морских средах как сапрофиты,
свободноживущие организмы и симбионты. Многие рыбы используют свет
колоний таких бактерий при спаривании, собирании в косяки и в качестве
охотничьей приманки. Светящиеся бактерии легко культивируются, и об их
биохимии известно довольно много [16, 17]. Весьма привлекательно и то,
что из них можно получать большое количество легко очищаемой люциферазы
(до 5% от массы клеток). В бактериях не содержится люциферин, по крайней
мере в том смысле, как в случае светляка. По-видимому, испускание света
происходит за счет комплекса люциферазы, восстановленного флавина (FMNH)
и длинноцепочечного насыщенного альдегида. Хотя химизм испускания света
бактериями еще не установлен полностью, в общих чертах принята следующая
схема:
оксидоредуктаза
NAD(P)H + FMN---------------> FMNH2 + NAD(P)
FMNH2 + люцифераза + 02-------> FMNH(OON)-люцифераза
FMNH(()ОH)-.iюцифераза + RCHO---------> FMN + RC02H + люцифераза + H20 +
свет.
Коммерческие препараты бактериальной люциферазы обязательно содержат
необходимую NAD(P)N • FMN-оксидоредуктазу в том или ином количестве, но
примеси других ферментов сильно ограничивают возможности ее
использования. Оба фермента нетрудно выделить из растертых в пасту
культивируемых клеток в достаточно чистом для аналитических целей виде
[18, 20].
31.2.4. Применение бактериальной люминесценции
Мы уже упоминали об использовании биолюминесценции светляка для
определения АТР. Данный метод, несомненно, является наилучшим для
определения этого часто встречающегося вещества, причем люциферазу
удалось иммобилизовать. Однако легче иммобилизовать другой фермент,
притом весьма доступный - бактериальную люциферазу. Ее можно использовать
в большом числе методов ферментативного анализа, связанного либо с
производством, либо с потреблением NADH или NAD(P)H. Методы определения
многих веществ перечислены в работе [21]. Приведем несколько примеров (в
скобках даны пределы обнаружения): NADH (0,1 фмоль), глюкоза (0,5-6
пмоль), малат (20-250 пмоль), тестостерон (0,2-5 пмоль), TNT (30 фмоль).
Определение TNT, к примеру, проводят в присутствии TNT-редуктазы,
использующей NADH как кофактор. Этот метод, очевидно, можно
распространить и на другие восстанавливающиеся соединения, для которых
имеется соответствующий фермент.
Подробное описание методов иммобилизации редуктазы и люциферазы можно
найти в работе [20]. Стеклянные палочки, используя диоксидазный клей,
покрывают слоем шариков органического стекла, содержащего ариламин.
Фермент связывают с шариками при помощи диазотирования.
Такую палочку можно использовать более 100 раз без потери активности,
хотя активность самих ферментов может уменьшаться почти в тысячу раз.
Детектирование света проводят, помещая палочку в буферный раствор,
содержащий определенное вещество, перед фотоэлементом. Поскольку палочка
захватывает большое количество субстрата (особенно NADH при высоких
