Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
концентрациях), после каждого анализа ее
492
Глава 31
необходимо тщательно промывать, что может приводить к еще большему
снижению активности.
Эта система непрерывно совершенствуется. Так, найдено, что эффективными
носителями могут служить Сефароза, активированная цианогенбромидом [11],
и найлон-6 [43]. В данной системе иммобилизовано около 25 различных
ферментов, причем практически без потери активности как самого фермента,
так и испускающих свет компонентов. Используя проточную систему, можно
определять NAD(P)H на уровне 6 фмоль.
31.2.5. Другие биолюминесцентные системы
Из множества люминесцирующих организмов, кроме светляка, более или менее
используют только медузу Aequorea, гидроид Obelia и морское перо Renilla.
В организме Renilla люциферин накапливается в виде енольного сульфата [8]
и высвобождается при помощи сульфокиназы. Приведенная ниже
последовательность реакций показывает, каким образом 3,5-
фосфоаденозинфосфат (РАР) и продукт реакции 3 -фосфоаденозин-5 -
фосфосульфат (PAPS) можно сопрячь с испусканием света и определять на
уровне 10-100 пмоль:
сульфокиназа
Люциферилсульфат + РАР -:----------> люциферин + PAPS
люцифераза
Люциферин + 02------------* оксилюциферин + С02 + свет
В настоящее время практическое значение этих метаболитов невелико, и
данный пример скорее иллюстрирует значение для анализа продолжающихся
исследований биолюминесценции.
Весьма привлекательным объектом для количественного анализа является Са2
+ , играющий центральную роль в процессах внутри клетки [2]. Современные
устройства для улучшения четкости изображений [40, 41] с разрешением
около 2 мкм позволяют даже локализовать источник Са2+ внутри больших
клеток. Рассматриваемый метод определения Са2+ основан на том, что
некоторые кишечнополостные (в частности, Aequorea и Obeilia) накапливают
люциферин в виде пероксида (1), связанного с люци-феразой, в результате
чего образуется единая частица, называемая фотопротеином. Последний
выделяют в присутствии большого количества ЭДТА, инактивирующего
эндогенные ионы кальция. С помощью микроиньекций фотопротеина экорина
можно определять Са2+ в цитоплазме на уровне 10"7 М.
Концентрация Са2+ в сыворотке слишком велика для прямого определения этим
методом. И поскольку методика довольно сложна для практического
осуществления, она служит скорее для демонстрации возможностей
биолюминесцентных методов, чем
Применение био- и хе милю мине сценции в биосенсорах
493
для конструирования реального биосенсора. Тем не менее можно
предположить, что химикам в конце концов удастся имитировать триггерную
реакцию, обеспечивающую легко детектируемый световой сигнал. С этой
целью, учитывая ее научную и практическую важность, можно было бы
обследовать множество синтетических соединений, у которых испускание
света катализируется определенным ионом или лигандом.
Рачок Cipridina hilgendorfii генерирует свет по тому же механизму, что и
светляк, несмотря на весьма отличающуюся структуру люциферина (2).
Родственный последнему люциферин (3) был сначала выделен из морского пера
Renilla reniformis, а затем найден в самых разнообразных организмах,
включая рыб, мелких креветок, головоногих и очень многих кишечнополостных
(например, медузу Aequorea aequorea) [9].
Химизм люминесценции, предложенный для этих люциферинов, тесно связан с
механизмом люминесценции нескольких эффективных чисто химических систем;
эта интерпретация представляет собой заметный успех органической химии
[30].
Для ряда люциферинов, в частности выделенных из пресноводного моллюска
Latia neritoides (4), земляного червя Diplocardia longa (5) и жгутикового
Pyrocystis lunula (6), механизм люминесценции не известен.
Люцифераза, выделенная из земляного червя Diplocardia longa, представляет
собой медьсодержащий белок и обладает пероксидазной активностью. Это
представляет ценность для определения Н202 и некоторых оксидаз [36]. Как
будет показано ниже, пероксидазные реакции могут служить основой
прекрасных хемилюминесцентных
494
Глава 31
методов анализа. Еще одна намного более активная, но крайне дефицитная
перокси-дазная система выделена из моллюска-камнеточца Pholas dactylus
[35].
31.3. Хемилюминесценции
Хотя фундаментальные механизмы, лежащие в основе испускания света при
протекании биологических и химических реакций, должны быть одними и теми
же. эти дез области развивались независимо примерно до середины 60-х гг.
Из биологических систем детальный механизм люминесценции обоснован только
в случае светляка Cypridina и кишечнополостных, тогда как механизмы
хемилюминесценции хорошо изучены для большого числа органических
соединений.
Хемилюминесценция в растворе практически всегда связана с окислительной
реакцией, в которой, как правило, участвует молекулярный кислород и
пероксид водорора. Способность к хемилюминесценции можно обнаружить у
широкого ряда соединений, и приведенные ниже структуры некоторых
хемилюминесцирующих веществ иллюстрируют это разнообразие.
