Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
нескольких других классов, обладающие способностью к обратимому
селективному связыванию. Так, лектины специфически связываются с
различными сахарами [5]; выделены и описаны мембранно-связанные белки,
специфичные к различным аминокислотам и сахарам [9]; ферменты обладают
нереакционноспособными центрами связывания аллостерических эффекторов
[10].
Обильную информацию о сродстве различных пар дает аффинная хроматография.
При разработке методики очистки белков аффинной хроматографией оценивали
многие комбинации рецепторов и лигандов [3]. Некоторые из этих систем,
например, флавин и флавин-связывающие белки, можно было бы приспособить
для использования в биосенсорах. Биосенсоры на основе обратимого
связывания биорецепторов можно разделить на две категории - биосенсоры
прямого и косвенного действия.
32.3.1. Биосенсоры прямого действия
В таких биосенсорах используется только обратимая реакция определяемого
вещества с частицами рецептора:
Определяемое вещество + рецептор определяемое вещество • рецептор (32.1)
508
Глава 32
Чтобы эту реакцию можно было непосредственно использовать, хотя бы у
одной из трех частиц должен изменяться спектр. Так, если при связывании
определяемого вещества меняется спектр поглощения рецептора, то, следя за
этим изменением, можно непосредственно измерять степень связывания и,
таким образом, определять интересующую концентрацию. Классический пример
- изменение спектра гемоглобина при связывании кислорода. Хотя изменение
цвета гемоглобина используют прежде всего для контроля степени его
оксигенации, этот эффект пригоден и для решения обратной задачи-
колориметрического определения парциального давления кислорода.
Конечно, поскольку реакция связывания кислорода с гемоглобином
чувствительна к pH, концентрации диоксида углерода и температуре, это не
лучший объект для конструирования на ее основе кислородного сенсора.
Однако, она напоминает о том, что для любого сенсора необходимо оценивать
влияние окружающих условий на способность рецептора к связыванию.
Еще одно, несколько более распространенное оптическое явление,
используемое для определения глубины протекания реакции, состоит в
тушении флуоресценции при связывании определяемого вещества с белком.
Благодаря наличию групп триптофана большинство белков флуоресцирует при
возбуждении зеленым светом. При связывании белка с определяемым веществом
может происходить тушение флуоресценции, если спектр поглощения
определяемого вещества перекрывается со спектром испускания триптофана.
Примером флуоресцентного метода анализа, имеющего клиническое значение,
является определение аминогликозидных антибиотиков, в частности гента-
мицина [23].
Следует отметить, что для систем прямого действия нет необходимости в
мембране, отделяющей химические компоненты биосенсора от анализируемой
жидкости, если рецептор предохраняется иммобилизацией на поверхности
оптического зонда. Тем не менее наличие мембраны все же желательно, чтобы
защитить рецепторный белок от некоторых компонентов внешнего раствора,
например ферментов.
32.3.2. Биосенсоры косвенного действия
Если при связывании определяемого вещества с рецептором ни у того ни у
другого спектр не изменяется, следует обратиться к аналогам определяемого
вещества, которые могут давать какой-либо регистрируемый оптически
сигнал. Химические процессы, протекающие в таких системах, в общем виде
описываются следующими уравнениями:
Определяемое вещество + рецептор <± определяемое вещество • рецептор
(32.2) Аналог определяемого вещества + рецептор аналог ¦ рецептор (32.3)
где аналог определяемого вещества либо сам обладает спектральными
свойствами, которые можно измерить, либо приводит к изменению оптических
свойств при связывании с рецептором. Если как-либо контролировать глубину
протекания второй реакции, то можно оценить, хотя и косвенно,
концентрацию определяемого вещества, поскольку изменение концентрации
последнего приводит к сдвигу равновесия во второй реакции. Возможности
реализации этой концепции в биосенсорах обсуждаются ниже.
32.3.2.1. Методы пространственного разделения. Как уже отмечалось при
описании характеристик оптических волокон, выходящий из оптического
волокна пучок в той или иной степени сфокусирован в зависимости от
источника света и апертурного числа оптического волокна. Это свойство
можно успешно использовать при независимом мониторинге отдельных
компонентов системы, если один из них иммобилизован вне "поля зрения"
оптического волокна. На рис. 32.4,а показано устройство биосенсора, в
котором эта задача решена.
Волоконно-оптические биосепсоры
509
Рис. 32.4. Конструкции глюкозного биосенсора на основе принципа
"разделения", т. е. измерения флуоресценции только несвязанных меченых
макромолекул, а: глюкозный сенсор с иммобилизованным Соп А в качестве
рецептора и декстран с флуоресцентной меткой в качестве свободного
движущегося аналога определяемого вещества [19]; б: альтернативная схема
