Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
воображением. Наградой им является чувствительность биосенсора и его
способность работать в биологических жидкостях без помех.
Недавно было показано, что как био-, так и хемилюминесцентные реакции
обеспечивают непревзойденную чувствительность, особенно в сочетании с
весьма совершенной аппаратурой для счета фотонов. Однако в обычных
устройствах их используют сравнительно мало. Целью данной главы является
описание принципов люминесцентных методов, демонстрация их
конкурентоспособности по сравнению с известными ферментными и
иммуноферментными методами, а также выяснение способов использования их
особых свойств. Использование люминесценции в биосенсорах еще находится
на стадии предварительных исследований, однако по ее применению в анализе
имеется обширная литература [10. 23, 24].
31.2. Биолюминесценция
Испускание света в результате реакций органических молекул в растворе
является интересным и к настоящему времени достаточно хорошо изученным
явлением. Многие слышали о биолюминесцирующих организмах, таких, как
светляки или морской черт. Такого рода организмы ответственны, в
частности, за фосфоресценцию моря. Однако очень многие организмы,
особенно морские, например головоногие, креветки и глубоководные рыбы,
демонстрируют даже более яркие эффекты. Те из биохимических реакций,
которые известны, весьма интересны, но на практике почти не используются.
Современное состояние различных аспектов биолюминесценции, особенно
биологических, рассмотрено в превосходном обзоре [19].
Для генерации света в природе используются различные биохимические
процессы. Простейшим из них, в смысле компонентов, является
биолюминесценция у небольших рачков Cypridina hilgendorfii. [52].
Механизм биолюминесценции этих организмов достаточно хорошо изучен и
служит основой для описания испускания света и другими
Применение био- и хемилюминесценции в биосенсорах
489
люминесцирующими организмами:
°2
Люциферин + люцифераза > оксилюциферин*
н2о
Оксилюциферин* > оксилюциферин + свет
В простейших случаях люциферин представляет собой небольшую
гетероциклическую органическую молекулу, которая при ферментативном
окислении превращается в оксилюциферин, находящийся в возбужденном
синглетном состоянии. Испускание света в этом состоянии идентично
флуоресценции, возникающей при возбуждении оксилюциферина обычным
образом.
Некоторые ферменты (люцифераза), участвующие в этой реакции, используют
обычные кофакторы, часто играющие центральную роль в метаболических
процессах. Поэтому реакции, сопровождаемые испусканием света, могут быть
сопряжены с многими биологически важными реакциями. Биолюминесцентная
реакция этого типа обнаружена у светляка (кофактор АТР), морского пера
Renilla (кофактор PAPS), светящихся бактерий (кофакторы FMN и NADH или
NAD(P)H) и медузы Aequorea (кофактор Са2 + ). В качестве потенциальных
компонентов аналитических приборов рассматривались и менее изученные
организмы, такие как редко встречающийся моллюск-камнеточец Pholas
dactylas и червь Diplocardia. В серии "Methods in Enzymology" имеется
хороший обзор [10] всех типов биолюминесцентных реакций. В настоящее
время подготавливается следующий том этой серии.
Вряд ли уместно детально обсуждать в этой книге химию и биохимию
биолюминесценции, но было бы полезно рассмотреть две наиболее широко
используемые системы, поскольку понимание общих принципов лежит в основе
любых возможных приложений.
31.2.1. Биолюминесценция светляка
Светляк наиболее хорошо изучен из светящихся организмов. Его химия,
биохимия и биология подробно рассмотрены в ряде обзоров [10, 19, 30, 31].
Это был первый организм, с помощью которого продемонстрировали
возможности детектирования света в анализе [50].
Хотя люциферин нетрудно синтезировать, люциферазу можно получить только
из светляка. Некоторые другие родственные виды из отряда Coleoptera имеют
такую же световую систему, однако эти организмы относительно редко
встречаются и не используются на практике. Методы синтеза люциферина, его
экстракции и очистки описаны в работах [10, 27]. Люцифераза относительно
устойчива, и ее легко получить с различной степенью чистоты. Для
достижения максимальной чувствительности из системы необходимо удалить
потенциальные ингибиторы фермента, такие как де-гидролюциферин
(обнаруживается как примесь в коммерческих препаратах) или пирофосфат, и
продукты ферментативной реакции - оксилюциферин и аденозинмоно-фосфат
[27].
Люцифераза катализирует все реакции, приведенные ниже:
Люциферин + люцифераза + Mg2+ + АТР > L-AMP-люцифериладенилат
L-АМП-люцифераза + 02-----> оксилюциферин*-люцифераза
Оксилюциферин*-люцифераза > оксилюциферин-люцифераза + свет (562 нм)
Для облегчения понимания все химические процессы показаны порознь. На
самом деле эти реакции могут осуществляться и в отсутствие фермента, при
этом эффективность
490
Г. шва 31
реакции по сравнению с ферментативной снижается примерно на 25% [33, 57].
В такой хемилюминесцентной реакции не требуется АТР, и, таким образом,
