Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
В тот же период был осуществлен синтез в дрожжах обратной транс-криптазы ретротранспозона дрозофилы (Резник и др. 1988, 1990) и белка семейства eRFl человека (Frolova et al., 1994).
1.2. ИСКУССТВЕННАЯ ХРОМОСОМА ДРОЖЖЕЙ
1.2.1. ИСКУССТВЕННАЯ ХРОМОСОМА ДРОЖЖЕЙ
КАК ВЕКТОР КЛОНИРОВАНИЯ
На рубеже 80-х годов стала очевидной возможность использовать искусственную хромосому дрожжей в качестве емкого вектора для клонирования ДНК геномов высших организмов, включая человека (Burke et al., 1987). Размер фрагментов ДНК, которые можно включать в YAC, сопоставим с размером природных хромосом дрожжей - в среднем 1,2 млн п.н., что в несколько раз больше размера клонов ДНК в бактериальных, фаговых и кос-мидных векторах (рис. 23). Большой размер клонируемых фрагментов позволяет уменьшить количество клонов, необходимых для перекрытия эквивалента генома. С помощыоУАС в качестве вектора стало возможным преодолеть трудности клонирования, которые связаны с особенностями структурной организации хромосом высших эукариот: присутствием в геноме множества повторяющихся элементов и метилированных участков, неравномерностью распределения генов по хромосомам и пр. (Schlessinger,1990).
Как уже отмечено выше, эффективная рекомбинационная система дрожжей позволяет вносить изменения в структуру клонированного фрагмента ДНК. При скрещивании дрожжей можно за счет митотической и мей-отической рекомбинации создать YAC, который содержит полностью желаемый фрагмент генома (Den Dunnen et al., 1992; Popov et al., 1996). Последующее введение такого YAC в клетки млекопитающих методом герминального переноса или с помощью других технологий позволяет провести функциональный анализ интересующей области генома (Pachnis et al. 1990; Peterson, 1997).
71
1.2.2. ПРОГРАММА ТЕНОМ ЧЕЛОВЕКА”
1.2.2.1. Роль искусственных хромосом дрожжей в изучении генома человека
Прочтение генетического кода генома человека стало центральной проблемой молекулярной биологии и генетики в конце 80-х годов. Национальные программы “Геном человека” были приняты во всех странах с-развитой наукой, в том числе и в бывшем Советском Союзе. В итоге за 10 лет интенсивной работы мирового сообщества на рубеже третьего тысячелетия вчерне расшифрована нуклеотидная последовательность генома человека, созданы физические карты каждой из 23 хромосом, идентифицированы гены, ответственные за многие наследственные заболевания. Полностью завершено секвенирование более десятка геномов микроорганизмов, растений, низших и высших эукариот. Возникли новые науки - геномика и протеоми-ка. Успехи в этих областях во многом обусловлены возможностью клонировать ДНК в искусственных хромосомах дрожжей (YAC).
Лаборатория молекулярной генетики дрожжей ИМГ РАН - единственный отечественный научный коллектив, который освоил и применяет прецизионную и трудоемкую технику конструирования YAC-клонотек с последующим скринингом YAC-клонов, их анализом и характеристикой, а также определение генетического контроля поддержания YAC в клетках дрожжей.
В рамках всесоюзной, а позднее всероссийской программы “Геном человека” нами были получены и охарактеризованы в 90-91-х годах YAC-клоно-теки ДНК дрозофилы и лимфоцитов человека для поиска протяженных не-сателлитных повторяющихся последовательностей рДНК генов.
Частичная библиотека генома D. melanogaster содержала YAC-клоны, размер которых от 90 до 500 т. п. н. определен при сравнении их с молекулярной массой природных хромосом, фракционируемых методом электрофореза в пульсирующем поле, с последующей визуализацией окраской бромистым этидием и ДНК-ДНК-гибридтацией. В соавторстве с сотрудниками лаборатории чл.-корр. РАН В.А. Гвоздева YAC-клоны были генетически картированы методом гибридизации in situ с политенными хромосомами слюнных желез личинок дрозофилы. Помимо клонов, локализующихся только в единственном сайте эухроматина, получены клоны с повторяющимися последовательностями из районов прицентромерного бета-гетерохроматина (Коган и др., 1991; Filipp et al., 1991). Анализ первичной структуры одного из YAC-клонов с гетерохроматичной ДНК Х-хромосомы дрозофилы выявил две последовательности, которые представили интерес для дальнейших исследований. Одна из них - тандем вовлеченных в процесс сперматогенеза генов Stellate, структура и функции которых в то время были мало изучены, а другая - последовательность псевдогена 18S рРНК вне известного ранее кластера 18S рДНК. Вопреки общепринятому мнению о том, что копии повторов, кодирующих 18S рРНК, идентичны, были получены результаты о существовании в геноме вариантов 18S рДНК генов и о возможности рекомбинации между ними. Этот факт свидетельствует о внутригеномной дивергенции и эволюции последовательностей рДНК. Таким образом, результаты молекулярного анализа гетерохроматических районов, которые включают утратившие свои функции элементы - псевдогены, могут прояснить отдельные этапы эволюции генома (Беневоленская и др., 1994).
72
Клонирование ДНК лимфоцитов человека было предпринято тоже для поиска повторяющихся последовательностей рДНК. К началу работы, проведенной в 1992-1993 гг. совместно с лабораторией академика А.А. Баева (ИМБ РАН), было известно, что кластер генов 5S рРНК человека локализован в хромосоме 1 и представлен двумя типами коротких повторов 2,2 и 2,6 т.п.н., их олигомерами из двух-четырех копий, а также протяженными участками (около 100 т.п.н.) с последовательностью рДНК (Little, Braaten,
