Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
2. Уровень митотической стабильности YAC существенно выше в диплоидной клетке по сравнению с гаплоидной. Возможно, диплоидность, свойственная дрожжам S. cerevisiae в природе, представляет более стабильную систему поддержания генетических структур.
3. Генотип клетки-реципиента также может определять уровень митотической стабильности YAC. Например, фактором ее повышения могут явиться мутации генов SRM, которые вызывают у дрожжей координированные изменения стабильности природных и рекомбинантных генетических структур. Нами обнаружен стабилизирующий эффект мутаций srml и srm8: скорость утраты YAC снижается на порядок по сравнению с этой величиной в клетках дикого типа (Смирнова и др., 1995).
76
1.2 4. СОЗДАНИЕ YAC-КЛОНОТЕКИ ХРОМОСОМЫ 7 ЧЕЛОВЕКА
В рамках проекта “Хромосома 19” в лаборатории, руководимой академиком Е.Д. Свердловым (ИБХ РАН), детально изучены последовательности длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов человека семейства К (LTR HERV-K) хромосом 19,21 и 22 человека, для которых определены первичная структура этих элементов и фланкирующей их геномной ДНК, локализация на физической карте, систематика, эволюционный возраст и предполагаемые регуляторные функции (Vinogradova et al., 1997; Khil et al., 1997; Артамонова и др., 2000). Анализ распределения копий LTR по всему геному свидетельствует о том, что некоторые хромосомы, в том числе 19-я, обогащены LTR, а другие содержат умеренное или малое число их копий. Для определения функциональной активности, специфичности распределения и времени интеграции в геном LTR HERV-K необходим сравнительный анализ этих последовательностей в разных хромосомах. В связи с этим в качестве еще одного объекта исследования авторских коллективов в РФ и ФРГ (Филиппе Университет Марбурга) в 1997 г. была выбрана хромосома 7 (Grzeschik et al,. 1994).
1.2.4.1. Клонирование в YAC методом
трансформационно-ассоциированной рекомбинации (TAR)
Для конструирования клонотеки нам была передана проф. К.-Х. Гржеши-ком (ФРГ) линия гибридных соматических клеток RuRag 14-4-7-44, где хромосома 7 представлена малым плечом со своей теломерой и другой теломерой, близко сцепленной с центромерой, а геном мыши - гетероплоидным набором хромосом, близким к 4п. Менее 10% клеток линии RuRag 14-4-7-44 после размножения культуры имеют малое плечо 7 хромосомы. Исходя из размеров генома мыши и 7р хромосомы следовало ожидать, что не более 1 из 2000 полученных YAC-трансформантов будут содержать ДНК человека при рутинном методе клонирования.
С целью сохранения аутентичности ДНК человека в YAC и повышения эффективности проводимой работы нами был применен альтернативный подход клонирования - метод трансформационно-ассоциированной рекомбинации (TAR) (Ketner et al. 1994; Larionov et al., 1996a). Искусственная хромосома дрожжей с клонированным фрагментом гетерологичной ДНК “конструируется” in vivo за счет сопутствующих процессу котрансформа-ции актов гомологичной рекомбинации между повторяющимися элементами ДНК человека (например Alu) и теми же повторами, включенными в состав вектора. В результате селективное клонирование ДНК человека происходит внутриклеточно на стадии возникновения трансформантов (рис. 25). Преимуществами метода являются практически полное отсутствие химерных фрагментов клонированной ДНК человека и многократное обогащение клонами ДНК человека при создании библиотеки из ДНК клеток монохромосомных соматических гибридов грызун/человек (Larionov et al., 1996b).
В опытах по клонированию TAR-методом использованы векторы, которые образуют в процессе трансформации линейные и кольцевые YAC.
77
Характерной особенностью TAR-векторов является отсутствие ARS-последовательности, обеспечивающей репликацию YAC в дрожжах. Известно, что в геноме человека ARS-подобные последовательности расположены достаточно часто, в среднем 1 на 30-40 т.п.н. (Stinchcomb et al., 1980). Следовательно, протяженные фрагменты ДНК человека, клонированные в YAC, могут с большой вероятностью содержать ARS-структуры, способные реплицироваться в дрожжах. Использование векторов, лишенных дрожжевого ARS, обеспечивает дополнительный механизм селекции.
1.2.4.2. Отбор и анализ YAC клонов с ДНК человека
Методом TAR-клонирования было получено 1806 первичных трансформантов. Многоступенчатый скрининг, включающий генетическую селекцию, гибридизацию колоний in situ с меченой тотальной ДНК человека и inter-Alu-PCR, показал, что 76 из них содержат вставку ДНК человека (рис. 26). Поскольку тотальная ЦНК клеток соматического гибрида содержит 0.05% ДНК человека, а выход клонов 7р среди TAR трансформантов составил 4,2%, что на два порядка выше, очевидно, что избранный метод TAR-клонирования оказался примерно в 100 раз эффективнее традиционного.
Размер клонированных фрагментов составил от 100 до 900 т.п.н. Анализ inter-Alu PCR продуктов показал отсутствие перекрытий вставок, что свидетельствует о случайном распределении клонов по хромосоме. Исходя из размеров и количества YAC-клонов, библиотека содержит суммарно около 12 млн п.н., что составляет 20% короткого плеча хромосомы 7.
