Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Сравнение нескольких репликаторов показало, что их структура высоко консервативна в области связывания с белками комплекса ORC, но варьирует в 3' направлении от сайта узнавания ORC и в областях, прилегающих к ACS (Newlon, Theis, 1993; Gilbert, 1998).
Некоторые из клонированных ARS уникальны (например ARS1, ARS14), другие повторены в геноме 3-15 раз (например ARS120, ARS131). Около 100 копий ARS последовательности находится в составе кластера рРНК генов на хромосоме XII дрожжей. Полирепликонная структура хромосом предполагает наличие в клетке механизма, запрещающего повторную инициацию репликации хромосом в пределах одного S периода. В составе экст-рахромосомных плазмид активность ARS-элементов также находится под строгим контролем: если два идентичных ARS-элемента расположены рядом, то только один из них активен. Фактором активации является инициирующий комплекс белков ORC, который взаимодействует с сайтом связывания, а выбор ARS зависит, по-видимому, от контекста фланкирующих последовательностей (Diffley, 1996; Newlon, 1997).
1.1.2. ЦЕНТРОМЕРА
Центромера является элементом хромосомы, присоединение нитей веретена к которому обеспечивает движение гомологичных хромосом к противоположным полюсам клетки в митозе и мейозе (Allshire, 1997). У большинства организмов хромосома имеет одну центромеру (рис. 24). Впервые центромеры эукариотических хромосом были изолированы у дрожжей, что позволило изучить их структуру и функцию (Clarke, Carbon, 1980). CEN элемент обусловливает стабильное наследование в митозе и мейозе хромосом и рекомбинантных плазмид. Копии бесцентромерных ARS-плазмид нестабильны в гаплоидной клетке дрожжей, поскольку нерегулярно сегрегируют в митозе (Murrey, Szostak, 1983а). Включение CEN ДНК в конструкцию репликативной ARS-плазмиды резко увеличивает ее стабильность и снижает число копий до 1-2 (Clarke, Carbon, 1985). Центромера определяет число копий плазмидной ДНК, по всей вероятности, за счет контроля не только сегрегации, но и числа раундов репликации (Tschumper, Carbon,
1983).
з*
67
Контроль стабильности и копийности оказался важнейшим свойством центромеры дрожжей, на котором основан общий принцип клонирования дрожжевых центромер по признаку стабилизации ARS плазмид.
Анализ нуклеотидной последовательности клонированных центромер дрожжей выявил сходный тип их организации. “Кор” центромеры, размером 220 т.п.н., резистентен к нуклеазам и состоит из трех элементов. Элемент CDEI (8 п.н.) гомологичен во всех центромерах, a CDEII - (центральная часть) не консервативен, но обладает общими с другими CEN признаками: АТ богатые (более 90%) сайты равной длины (78-86 п.н.), где А и Т чередуются с периодичностью 6-7 оснований. Элемент CDEIII (26 п.н.) представляет консервативный сегмент с двухсторонней симметрией. Мутационный анализ выявил первичную структуру, необходимую для функции центромеры. (Clarke, Carbon, 1985; Fitzgerald-Hayes, 1987).
Выделены белки, которые связываются с CEN и образуют комплекс -примитивный кинетохор, т.е. место прикрепления нитей веретена. Присоединение к CEN тубулинов микротрубочек происходит за счет взаимодействия с центромерными белками. Важную роль в организации уникальной структуры центромеры играют гистоновые белки. Репрессия гистонов Н2В или Н4 делает клетки неспособными к сегрегации хромосом, повышает чувствительность “кора” к нуклеазам, меняет сайты атаки нуклеаз в ДНК, фланкирующей CEN. Это свидетельствует о том, что гистоновые белки вовлечены в сборку хроматиновой структуры центромеры, отличающейся от нуклеосомной организации. Показана связь репликации ДНК с функцией центромеры и возможность ее транскрипционной инактивации (Hegeman, Fleig, 1993; Clarke, 1998).
Центромеры разных хромосом дрожжей функционально взаимозаменяемы, несмотря на определенные различия их первичной структуры. Снижение активности центромеры в результате сайт-специфического мутагенеза или делетирования одинаково проявляются в нарушении митоза и мейоза ARS плазмид, искусственных (YAC) и природных хромосом (Clarke, 1998). Митотическая стабильность рекомбинантных структур с центромерой (типа YRCp и YAC) на два порядка ниже стабильности природных хромосом.
1.1.3. ТЕЛОМЕРА ДРОЖЖЕЙ
Теломера - конец линейной хромосомы эукариот — является третьим структурно-функциональным элементом, который обеспечивает стабильность поддержания хромосом и их способность к трансмиссии в виде целостных единиц генетической информации (рис. 24). Теломера выполняет ряд важнейших функций, главные из которых - стабилизация хромосом за счет предотвращения слияния их концоь и деградации ядерными нуклеаза-ми, завершение репликации концов и фиксация их положения в ядре, а также регуляция экспрессии генов, локализованных вблизи теломер (De Lange, 1998; Cooper, 2000). Показана связь между теломерой, ДНК-полиме-разами, белками репарации ДНК и компонентами центросом. Это свидетельствует о многозначности функции теломеры в поддержании хромосом и в регуляции движения хромосом в митозе и мейозе (De Lange, 1998; Cooper, 2000).
68
Наиболее детально организация суб- и теломерных последовательностей изучена у дрожжей. Концы хромосом дрожжей состоят из блоков Cj_3A, тандемно повторенных 20-60 раз. Большая часть блока теломерных повторов имеет структуру двунитевой ДНК и лишь его небольшая часть образует выступающий однонитевой 3'-конец. У дрожжей к теломерной последовательности повторов С, 3А примыкают субтеломерные последовательности: 3-4 тандемных повтора Y-элемента длиной 6,7 т.п.о. и Х-после-довательность, сильно варьирующая по длине от 0,3 до 3 т.п.н. Y- и Х-обла-сти содержат ARS последовательность (Zakian, 1995). Теломеры разных хромосом идентичны по структуре, но различаются по длине. Число копий теломерных повторов различно в разных штаммах дрожжей и может меняться во время жизненного цикла клетки (Szostak, Blackburn, 1982; Blackburn, 1984).
