Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
74
Этот факт согласуется с нашими данными о достоверном увеличении частоты спонтанных реверсий к прототрофности по аденину у некоторых из случайно отобранных YAC-трансформантов. Очевидно, присутствие YAC в клетке дрожжей способно существенно повышать вероятность возникновения и селекции специфичных мутаций (Арман и др., 1993).
1.2.3.3. Структурные перестройки YAC
Успех применения YAC для любых молекулярно-генетических задач зависит от его структурной и митотической стабильности. Множество повторяющихся элементов в ДНК высших эукариот индуцирует процессы гомологичной рекомбинации в ДНК YAC, приводя к внутри- и межмолекуляр-ным перестройкам клонированного фрагмента.
Перестройки структуры клонированного фрагмента ДНК YAC: делении, инсерции, обмены - были количественно оценены нами в опытах с “маркированными” YAC. Методом ретрансформации в клонированную ДНК более двухсот YAC была встроена кассета Alu-HIS3-Alu. Анализ маркированных фенотипом Ь^+-ретрансформантов показал, что в процессе ретрансформации и последующих митозов клетки происходит ряд генетических эффектов.
1. Интеграция кассеты Alu-HIS3-Alu происходит не только за счет гомологии Alu повторов в ДНК человека, но и вследствие гомологии гена HIS3 дрожжей в составе кассеты. Методом гибридизации ДНК Alu зонда с ДНК хромосом каждого из 60 случайно отобранных His+ ретрансформантов обнаружено, что у 6 из них HIS3 маркер локализуется не в YAC-последовательности. Два акта интеграции произошли в хромосому 15, где расположен HI S3 ген, остальные четыре в хромосомы 2, 4, 11, и 14 дрожжей.
2. Выборка из 121 маркированного YAC была использована для определения частоты делеций в YAC-последовательности при репликации и поддержании его в дрожжах. Контролем служили рYAC-векторы, не содержащие ДНК человека. Анализ не менее 50 субклонов каждого ретрансформанта (всего 6561) после 20-30 генераций выявил, что 239 субклонов, несущих YAC (4,5%), утратили HIS3 маркер. В контроле эта величина равна 0,06%. Таким образом, частота делеций кассеты Alu-HIS3-Alu в YAC с ДНК человека повышается на два порядка.
3. Нам удалось также количественно оценить частоту обменов между ДНК YAC и природных хромосом дрожжей: 5% ретрансформантов, утративших YAC во время инкубации, сохраняют Р^+-фенотип. Генетический анализ показал, что последовательность HIS3 обнаруживается как в районе локуса этого гена, так и в локусах других хромосом. Частота рекомбинационных событий составляет 10~2.
При определении размеров YAC всей клонотеки было обнаружено, что часть первичных трансформантов содержит не один, а несколько YAC (2-4), отличающихся по молекулярной массе. Этот факт отмечен в публикациях и других авторов, которые считали его следствием проникновения в клетку при трансформации нескольких рекомбинантных структур одновременно. Однако выявлена и другая причина: несколько YAC в одной клетке могут явиться результатом структурной перестройки одного и того же
7S
YAC-клона. Была прослежена судьба YAC в 6 линиях независимых трансформантов. Генетический анализ диплоидных гибридов этих линий после пятикратного последовательного скрещивания показал, что ни один из двух или более YAC не утрачивается при прохождении клеткой митоза и мейо-за. Все три генетических маркера YAC обнаруживают косегрегацию и мен-делевское наследование, т.е. проявляют свойства одиночной автономно-ре-плицирующейся структуры. Тот же вывод следует из результатов рестрикт-ного анализа и опытов по ДНК-ДНК-гибридизации в клетках постмейоти-ческих сегрегантов. Очевидно, в изученных линиях имеет место структурная нестабильность клонированного в YAC фрагмента ДНК, при которой только определенные перестройки жизнеспособны и поддерживаются клеткой. Эти результаты количественно подтверждают данные других авторов об актах рекомбинации, как источнике химерных YAC (Larionov et al., 1994).
Таким образом, сочетание методов молекулярной биологии и классической генетики при анализе YAC-клонотек, содержащих ДНК из разных источников, дало возможность количественно оценить вероятность нарушения аутентичности клонированной ДНК (Арман и др., 1999).
1.2.3.4. Митотическая стабильность YAC
Стабильность поддержания YAC, как и природных хромосом, зависит от эффективности их репликации и точной сегрегации в дочернюю клетку в процессе митоза. Эта величина у YAC составляет lO2, несмотря на присутствие всех трех компонентов хромосомы: ARS, CEN, TEL, обеспечивающих контроль репликации и сегрегации. Величина митотической стабильности YAC имеет тенденцию возрастать с увеличением размера вставки (Арман и др., 1993). Наблюдаемые отклонения от этого правила обусловлены, по-видимому, специфичностью нуклеотидной последовательности вставки. Определение митотической стабильности коллекции YAC-клонов с ДНК человека выявило и другие факторы, влияющие на частоту утраты YAC.
1. Скорость утраты YAC в митозе зависит от типа клонирующего вектора. Наиболее стабильными оказались YAC на основе векторов pJS 97-98. По-видимому, этот факт можно объяснить тем, что каждый из двух pJS векторов, образующих плечи YAC, имеет в составе ARS Н4. Как известно, увеличение числа ARS повышает стабильность рекомбинантных структур.
