Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
1.2.4.3. Поиск терминальной последовательности 7р
Субтеломерные области хромосом человека содержат ARS-последовательности (Flint et al., 1997), этот факт мог бы повысить вероятность клонирования концов хромосом TAR-вектором, не содержащим ARS дрожжей.
Изучение концов хромосом является необходимым этапом в определении границ физической и генетической карт хромосом любых геномов. Клонирование концов хромосом представляло определенные сложности и первые фаговые и космидные библиотеки практически не содержали теломерных последовательностей. Применение метода “полу-YAC’' для клонирования концов хромосом (Riethman et al., 1989) весьма трудоемко. В этой работе лишь один YAC из 600 “иолу-YAC” клонов был строго локализован в области теломеры 7q. В более поздней работе для отбора 40 YAC клонов, представляющих 31 конец хромосом, пришлось анализировать 12 000 первичных трансформантов (Vocero-Akbani et al., 1996).
Поиск терминальной последовательности короткого плеча хромосомы 7 человека в ДНК YAC-клонов проведен нами методом ПЦР с парой праймеров (D1 и D2), которые образуют ПЦР-продукт размером 246 п.н. при амплификации ДНК соматического гибрида с коротким плечом хромосомы 7, и не образуют продукта с ДНК дрожжей, мыши и соматического гибрида, содержащего 7q (Brown et al., 1990).
Четыре YAC-клона, позитивных в реакции с D1-D2, локализованы в 7р21, 7р15.1-7р15.3, 7р15.1-7р15.2, 7р15.1-7р15.2 областях хромосомы 7 ме-
78
тодом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с метафазными хромосомами человека продуктов Alu-PCR ДНК YAC-клонов. Следовательно, эти клоны не являются фрагментами теломеры 7р, а лишь содержат гомологичные последовательности, которые выполняют функцию теломерных концов в YAC. Этот тип YAC составлял основной генетический шум, на фоне которого велся поиск клонированных терминальных последовательностей человека во всех работах с векторами, имеющими только одну теломеру.
Механизм образования структуры, функционирующей на конце искусственной хромосомы дрожжей, мало изучен. Известно, что такие последовательности часто встречаются в геноме эукариот и локализуются, в частности, у человека в разных, нетерминальных сегментах хромосом (Brown et al., 1990; Monfouilloux et al., 1998). Такие концы обладают структурной нестабильностью: в процессе репликации и размножения клонированный фрагмент может существенно укорачиваться. После нескольких пассажей наряду с линиямч клеток, несущих первичный YAC, нами обнаружены линии с YAC меньшего размера. Подобные факты отмечены и в других работах (Larionov et al., 1996а).
Для более направленного поиска теломерных и субтеломерных клонов мы использовали 5 пар STS праймеров в качестве тестов на последовательности, расположенные на разном расстоянии от теломеры хромосомы 7р (до 300 т.п.н). ПЦР продукты были обнаружены с тремя последовательно расположенными праймерами в ДНК YAC 24-17. Следовательно, этот YAC содержит терминальный фрагмент короткого плеча 7 хромосомы.
Локализация клона YAC 24-17 на терминальном участке 7р хромосомы подтверждена методом FISH. ДНК данного клона гибридизуется также с несколькими, преимущественно терминальными, районами других хромосом: 7cen; lpter; lq41; 5qter; 16qter; 16pter. Множественная гибридизация подтверждает данные о том, что терминальные области разных хромосом обладают сходной структурой и богаты консервативными повторами (Monfouilloux et al., 1998).
Итак, в клонотеке хромосомы 7р, размером 12 млн.п.н, удалось клонировать терминальную последовательность этой хромосомы. Успех клонирования концевой области с ARS-последовательностью обусловлен, возможно, применением TAR векторов, не содержащих области начала репликации (Глазкоза и др., 2000).
1.2.4.4. Поиск последовательности LTR семейства HERV-K
Среди частичной YAC-клонотеки хромосомы человека 7р проведен поиск и локализация последовательностей длинных концевых повторов (LTR) эндогенных ретровирусов семейства HERVK (HML-2), а также анализ их возможной функциональной значимости. Известно, что в геноме человека до 4,5% ДНК составляют последовательности эндогенных ретровирусов (Lander et al., 2001). Имеются данные об участии HERV в регуляции генов, в процессах клеточной дифференцировки, иммунного ответа, злокачественного перерождения и патологии некоторых аутоиммунных заболеваний (Kazazian 1998; Larsson, Andersson, 1998). Одно из наиболее многочисленных семейств - HERV-K (HML-2) - представлено в геноме не только ретровирус-подобными элементами, но и большим количеством одиночных концевых
70
22
21
15.3
15.1 14 13
11.2 11.1
21.1
21.3
22
23.1
31.3
32
34
36
YAC 22-19
YAC 24-13
YAC 22-55
Puc. 28. Локализация YAC-клонов, содержащих HERV-K LTR, на идеограмме хромосомы 7
повторов - LTR (Leib-Mosh et al., 1993; Sverdlov, 1998). Интерес к этим последовательностям помимо их эволюционной значимости (Sverdlov,
2000) обусловлен тем, что они содержат набор регуляторных элементов: энхансер, промотор, сигнал полиаде-нилирования, участок связывания стероидных гормонов, - это позволяет предполагать потенциальную способность LTR модулировать активность генов. Действительно, все больше фактов свидетельствует об участии LTR в регуляции и экспрессии расположенных рядом генов (Sjottem et al., 1996; Mager et al., 1999; Baust et al., 2000).
