Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Свердлов Е.Д. -> "Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1" -> 34

Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.

Свердлов Е.Д. Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 — М.: Наука, 2003. — 372 c.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка): perspektivimoleculyargenetiki2003.djvu
Предыдущая << 1 .. 28 29 30 31 32 33 < 34 > 35 36 37 38 39 40 .. 199 >> Следующая

Структура YAC и схема клонирования представлены на рис. 23. Первые YAC-векторы содержат в кольцевой структуре все необходимые элементы хромосом: область начала репликации (ARS), центромеру (CEN), селективные маркеры по обе стороны от центромеры (TRP1 и URA3) и две теломерные последовательности (TEL). Уникальные сайты для клонирования гете-рологичной ДНК расположены в гене SUP4, разрыв последовательности которого приводит к изменению фенотипа црожжей. Эти фенотипические изменения свидетельствуют о наличии вставки гетерологичной ДНК в YAC.
Клонирование ДНК в YAC стало доминирующим подходом для конструирования библиотек геномов эукариот. В рамках международной программы “Геном человека” зарубежными исследователями в начале 90-х годов было создано несколько библиотек тотальной ДНК генома (Anand et al., 1990; Albertsen et al., 1990; Bellanne-Chantelot et al., 1992) и хромосом-специ-фичные клонотеки ДНК человека (Sleister et al., 1992; Green et al., 1994: Qin et al., 1993; McCormick et al., 1989).
К числу основных преимуществ YAC в качестве вектора относятся: большая емкость (размеры YAC могут достигать размеров природных хро-
64
BamH
Частичная рестрикция EcoRI с фракционированием фрагментов ДНК
Рестрикция Ecorl/BamHI с
дефосфорилированием
фрагментов
EcoRI EcoRI L
TEL
Лигирование
TEL
FxoR'
b-C^-ta TRPl : ARS : CEN
вставка
EcoRI
URA3 TEL
YAC (0,1-2 млн п.н.)
Puc. 23. Схема конструирования YAC in vitro
3. Проблемы и перспективы...
мосом дрожжей), позволяющая клонировать целиком протяженные гены высших эукариот; возможность манипулировать структурой YAC на основе использования рекомбинационной системы дрожжей (сайт-специфической мутагенез, делетирование, изменение ориентации вставки относительно вектора и т.п..); способность обеспечить клонирование ряда важных последовательностей, не поддающихся клонированию в прокариотических векторах, и др.
Разработаны методы получения трансгенных животных, использующие, в частности, введение YAC в эмбриональные стволовые клетки (Peterson et al., 1997). Основной недостаток YAC - относительно часто встречающаяся неаутентичность вставок и природных последовательностей генома - “химе-ризм”. Эти расхождения возникают как вследствие манипуляций in vitro при конструировании YAC, так и в результате воздействия на YAC рекомбинационной системы хозяйских дрожжевых клеток. К настоящему времени разработаны методы, позволяющие в значительной степени преодолевать указанный недостаток. Более подробно применение YAC, их преимущества и недостатки рассмотрены в основном тексте обзора.
В наших исследованиях, результаты которых рассматриваются в настоящем обзоре, можно выделить следующие два направления.
1. Создание и структурно-функциональный анализ искусственных хромосом дрожжей (YAC) - рекомбинантных наследственных структур, способных поддерживаться в дрожжевых клетках и содержащих генетический материал высших эукариот. Успешность создания таких структур зависит от знания механизмов генетической стабильности дрожжевых клеток.
2. Изучение генов, опосредующих координированное поддержание ядер-ных и митохондриальных наследственных структур дрожжевой клетки. Это направление как раз и имеет своей целью прежде всего выяснение механизмов генетической стабильности S. cerevisiae.
1. НАСЛЕДСТВЕННЫЕ СТРУКТУРЫ ДРОЖЖЕЙ,
КОНСТРУИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ИСКУССТВЕННЫХ ХРОМОСОМ
ДРОЖЖЕЙ (YAC), СОДЕРЖАЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ
1.1. ОСНОВНЫЕ СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ХРОМОСОМЫ
1.1.1. ОБЛАСТИ НАЧАЛА РЕПЛИКАЦИИ (ori)
И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ARS ДРОЖЖЕЙ
Хромосома эукариот содержит множество дискретных участков - области начала репликации {ori), где в поздней М и G1 фазе клеточного цикла собирается пререпликативный комплекс и формируется двунаправленная ре-пликационная вилка, которая активируется в S-фазе. Нуклеотидные последовательности ori репликации у дрожжей S. cerevisiae идентичны репликаторам - автономно реплицирующимся последовательностям (ARS), которые определяются по их способности к автономной репликации в составе экст-рахромосомных плазмид (рис. 24).
Размер ARS у дрожжей колеблется от 100 до 150 нуклеотидов. Центральный элемент (домен А) содержит консенсус из 11 нуклеотидов (ACS -
66
autonomous consensus sequence), ассоциированный с двумя или тремя короткими мотивами (Bl, В2, ВЗ), которые могут различаться последовательностями, но консервативны функционально. Это усилители репликации -энхансеры, которые не обладают собственной активностью, но необходимы для функции ACS. 3'-область ARS содержит элемент DUE (double unwinding element), богата AT и обладает низкой термодинамической стабильностью.
Последовательность ACS служит сайтом посадки комплекса ORC (origin recognition complex), состоящего из шести белков. За посадкой ORC следует формирование преинициирующего комплекса, в котором участвуют белок Cdc6 и шесть белков Mem. Протеинкиназа Cdc7/Dbf4 активирует преиници-ирующий комплекс, после чего инициируется репликация ДНК, и комплекс белков Mem следует за вилкой репликации, а комплекс ORC остается связанным с оп-элементом (Toyn et al.,1995).
Предыдущая << 1 .. 28 29 30 31 32 33 < 34 > 35 36 37 38 39 40 .. 199 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed