Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Свердлов Е.Д. -> "Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1" -> 36

Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.

Свердлов Е.Д. Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 — М.: Наука, 2003. — 372 c.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка): perspektivimoleculyargenetiki2003.djvu
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 199 >> Следующая

Тандемные повторы теломеры синтезируются при участии теломераз -рибонуклеопротеиновых ферментов (Greider, Blackburn, 1985). Теломе-раза является РНК-зависимой ДНК-полимеразой, т.е. обратной транскрип-тазой. Уникальная особенность этого фермента состоит в том, что РНК в его составе служит матрицей для синтеза теломерной ДНК. У дрожжей размер РНК-компонента теломеразы может доходить до 1 т.п.н., однако матричный участок РНК, который комплементарен теломерному повтору, представлен единственной копией, длина которой не превышает размера двух повторов. В зависимости от теломеразной активности длина теломеры может увеличиваться, а при ингибировании или репрессии фермента - укорачиваться (Bryan, Cech, 1999; Рисе, 1999). Установлена и широко обсуждается связь между активностью теломеразы, канцерогенезом, старением клеток и организма (Богданов, 1998; Reddel 1998).
Известны белки, которые взаимодействуют с одно- и двухцепочечной ДНК теломеры. Дефекты в экспрессии этих белков тоже могут приводить к удлинению или укорачиванию теломеры, к потере одноцепочечных повторов, слиянию концов хромосом и апоптозу (De Lange, 1998; Smorgorzewska et al., 2000). Один из таких белков - белок дрожжей RAP1, сайт связывания которого - основа формирования репрессивного хроматина, а длина теломеры обусловлена счетным механизмом, который запускает RAP1 (Morse, 2000).
1.1.4. АВТОНОМНЫЕ ВЕКТОРЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ
Биотехнологический синтез цитокинов, ростового гормона, инсулина, эпидермального фактора роста, бета-эндорфина человека и многих других биологически активных соединений осуществляется в настоящее время во многих странах, благодаря созданию автономно реплицирующихся экстра-xpoN осомных векторов дрожжей.
Дрожжи - прекрасные продуценты для биотехнологии: не патогенны и не продуцируют токсины, растут на дешевых субстратах, генетически стабильны, способны, в отличие от прокариот, гликозилировать синтезируемые гетерологичные белки, активные in vivo. Для клонирования и экспрессии гетерологичной ДНК используют YRp и YEp - челночные векторы, автономно реплицирующиеся в клетках дрожжей и бактерий (Арман и др.,
1984). Эти векторы создаются на основе простейших конструкций -Yip , ко-
69
Таблица 1.1. Основные свойства векторов дрожжей (Рыбчин, 1999)
Характеристика YIp YRp YRp YCp 1 YLp YAC
Автономная Нет Да Да Да Да Да
репликация
Число копий на 1 25-200 1-20 1-2 10-50 1-2
клетку
Репликатор Нет ori 2 мкм ДНК ARS ARS ARS ARS
Другие элементы Нет STB 2 мкм ДНК* Нет CEN TEL CEN, TEL
Частота трансфор- 10“5 10^-10~2 ю-3 1(Г3 IQ"3 10^-10 3
мации на 1 мкг ДНК
* STB - центромероподобный сайт двухмикронной плазмиды.
торые, помимо бактериальной основы, содержат только маркерный ген дрожжей и трансформируют дрожжи, интегрируясь в хромосомы. Автономно реплицирующиеся последовательности (ARS) хромосом дрожжей и других организмов, включенные в состав векторов Yip, обеспечивают автономное эксграхромосомное поддержание плазмид. Такие плазмиды называются репликативными (YRp); уровень их митотической стабильности является мерой активности ARS (Легчилина и др., 2001) YRp-плазмиды трансформируют дрожжи с высокой частотой, число копий сильно варьирует (5-50 на клетку), уровень митотической стабильности колеблется в широком диапазоне (Арман, Легчилина, 1982). Классификация и свойства векторов приведены в табл. 1.1. и на рис. 24.
Гетерологичная экспрессия в дрожжах, включающая синтез и в некоторых случаях секрецию чужеродных белков, была важнейшей проблемой биотехнологии 80-х годов. Существенным вкладом в решение проблемы явились анализ и подбор факторов оптимизации системы “вектор-клетка”.
В наших работах по оптимизации стабильности репликативных экспрес-сионных плазмид для задач биотехнологии обнаружено, в частности, что гетерологичная ДНК со структурными свойствами ARS способна функционировать в дрожжах как усилитель — энхансер репликации. Анализ последовательности ДНК вируса гепатита В (HBY aywl) выявил два фрагмента, у которых обнаружены признаки В домена ARS дрожжей S. cerevisiae (см. раздел 1.2.1.): повышенное содержание АТ пар, А2_5 треки по шагу спирали ДНК, присутствие несовершенных ACS гомологов (9 из 11) и наличие статичного изгиба ДНК (Легчилина и др., 1990). Включение в конструкцию YRp-плазмид данной области ДНК вируса значительно увеличивает их митотическую стабильность в трансформантах дрожжей (Ефименко и др., 1991; Legchilina et al., 1991).
Повышение митотической стабильности за счет энхансера репликации вируса HBV происходит не только у репликативных плазмид, с ARS хромосом, но и у плазмид с ori 2 мкм ДНК (Арман и др., 1985; Легчилина и др., 1990; Ефименко и др., 1991).
70
Нами было установлено, что эффективность экспрессии в дрожжах и соответственно выход желаемого продукта можно увеличить многократно за счет ряда факторов: 1) повышения стабильности вектора при включении в его состав гетерологичного энхансера репликации; 2) минимизации размера вектора для повышения числа его копий; 3) модификации “кассеты экспрессии” (индуцибельный промотор, специфичный терминатор, два АТГ кодона начала транскрипции), 4) создания штамма реципиента с ускоренным ростом культуры путем гибридизации неродственных гаплоидных штаммов (Арман и др., 1985; Чеперегин и др., 1990). Использование этих факторов оптимизации позволило создать первые отечественные штаммы дрожжей -высокоэффективные продуценты белка гена поверхностного антигена вируса гепатита В (HbsAg) для получения вакцины (Грановский и др., 1986; Чеперегин и др., 1990). В совместной работе с Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского разработаны условия ферментации штаммов - продуцентов и технология очистки белка, что подтверждено пятью авторскими свидетельствами и патентом (Арман и др., 1989). Вакцина прошла контроль в ГИСК им. Тарасевича, клинические испытания и была передана в производство.
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 199 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed