Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
1989). Для более детального изучения организации и полиморфизма кластера генов 5S рРНК нами был проведен скрининг 903 YAC-трансформантов, в результате которого были отобраны 12 клонов, давших положительный сигнал с зондом 5S рРНК. Субклонирование и рестриктный анализ ДНК восьми из этих клонов показали, что они содержат кластер повторов с размером повторяющегося элемента 6 т.п.н., в котором имеются три равных субэлемента, содержащих последовательность псевдогена 5S рРНК (400 п.н.). Промежутки между субэлементами различаются по наличию сайтов рестрикции. Эти данные подтвердили предположение о гетерогенности организации кластеров повторяющихся генов рДНК у человека. Полиморфизм может быть фактором, модулирующим экспрессию генов в составе кластера (Тимофеева, Захарьев, 1994).
1.2.2.2. Проект “Хромосома 19”
Проект “Хромосома 19” в рамках программы “Геном человека” предполагал осуществить картирование, секвенирование и изучение роли функционально-значимых некодирующих последовательностей. В дополнение к ко-смидной и кДНК-вой клонотекам хромосомы 19 была создана частичная клонотека протяженных фрагментов ДНК в искусственных хромосомах дрожжей.
В качестве исто шика ДНК хромосомы 19 были использованы две линии гибридных соматических клеток (грызун-человек) GL12-42 (ИБХ РАН) и UU5HL-58 (LLNL, США), содержащие в качестве человеческого компонента только хромосому-19.
Скрининг клонотеки (более двух тысяч трансформантов) с помощью интегративной селекции и методом гибридизации колоний in situ с зондами повторяющихся элементов ДНК человека показал, что YAC-клоны с ДНК человека составляют около 1%.
Клоны с фрагментами ДНК хромосомы 19 человека, использованные в нашей работе, были переданы для физического картирования и депонирования в банк данных в Национальную лабораторию Ливермора (США), с которой сотрудничал российский коллектив проекта “Хромосома 19”.
1.2.3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ
ИСКУССТВЕННОЙ ХРОМОСОМЫ
1.2.3.1. Проблема химер
Коллекция нескольких тысяч YAC-клонов, содержащих фрагменты ДНК дрозофилы, лимфоцитов и хромосомы 19 человека, предоставила замечательную возможность использовать YAC в качестве модельной систе-
74
мы для исследования структурной и митотической стабильности искусственной хромосомы.
При анализе библиотек тотальной ДНК генома и хромосом-специфич-ных клонотек ДНК человека, созданных в начале 90-х годов, обнаружено от
20 до 50% химерных клонов, которые вносят артефакты в исследования нуклеотидной последовательности генома и при сопоставления физических и генетических карт хромосом (Green et al., 1991; Wada et al., 1994).
Механические разломы, одно- и двунитевые разрывы ДНК, а также ли-гирование плеч вектора более чем с одним фрагментом ДНК рестриктов из разных областей хромосомы могут приводить к образованию химерных YAC, которыми трансформируют сферопласты дрожжей. Для снижения вероятности таких событий in vitro процедуры с клонированной ДНК проводили в легкоплавкой агарозе, иммобилизуя молекулы ДНК. Доля химер уменьшается и при снижении концентрации клонируемой ДНК человека в лигиру-ющей смеси. Сходный эффект “разведения” имеет место при создании YAC-клонотеки из клеток соматических гибридов, где доля ДНК человека составляет около 1%. В таких YAC-клонотеках доля химер не превышает 10%.
В последние годы была предложена новая технология получения клонов в составе YAC - метод трансформационно-ассоциированной рекомбинации (Larionov et al., 1996а). Метод исключает лигирование YAC in vitro и снижает тем самым вероятность образования химер. Детально метод описан ниже (см. раздел 3.4.1. и рис. 25).
In vivo нестабильность структуры YAC возникает в процессе митотического деления дрожжей при рекомбинации повторов в ДНК YAC или гомологичных сайтов клонированной и природной ДНК дрожжей. Частота всех типов перестроек в ДНК YAC снижается в 5-8 раз при использовании в качестве реципиентов дрожжей с мутациями в генах, контролирующих репарацию/рекомбинацию (Kouprina et al., 1999).
1.2.3.2. Генетические эффекты поддержания YAC
в клетках дрожжей
Нами исследована возможность изменений в геноме клетки-реципиента, содержащей YAC в дополнение к набору собственных природных хромосом.
Трансформанты дрожжей, в генотипе которых имеется мутация гена ADE2, образуют колонии, накапливающие красный пигмент. В наших опытах, помимо красных, с большой частотой, возникали колонии трансформантов, лишенные пигментации, но содержащие YAC со вставкой ДНК. Анализ полового потомства пяти непигментированных YAC-трансформантов с ДНК дрозофилы показал, что у каждого из этих трансформантов утрата пигментации обусловлена ядерной рецессивной мутацией гена ADE5. Аналогичные результаты получены при генетическом анализе десяти YAC-клонов со вставками ДНК лимфоцитов человека. Мутантные сайты в локу-се ADE5 оказались изоаллельными. В массовых рассевах клеток штамма реципиента АВ1380 не удалось обнаружить спонтанно возникших ade5-MyTa-ций. Следовательно, изоаллельность мутаций ade5 в случайных выборках трансформантов, несущих YAC со вставкой ДНК дрозофилы и лимфоцитов человека, является следствием специфической индукции и селекции этих мутаций в процессе трансформаций.
