Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Цитохимическое окрашивание ЭС клеток на выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы позволяет объективно оценить степень диф-ференцированности этих клеток (Лойд и др., 1982). Окрашиваются колонии, сформированные недифференцированными эмбриональными клетками. Клетки фидера не дают положительной реакции на выявление активности щелочной фосфатазы (рис. 106).
Разные линии мышиных ЭС клеток гетерогенны по морфологии, требовательны к составу питательных сред, сыворотки и качеству фидера. Вопрос о том, какие из ЭС клеток являются плюрипотентными, т.е. способными нормально развиваться в составе целого зародыша, яьляется важнейшим при решении задач биологии развития и эмбриотехнологии (Межевикина и др., 1998, 2001).
Б. Трансформация ЭС клеток геном lif. Показано, что для поддержания ЭС клеток в плюрипотентном состоянии необходимо их культивирование на фидерном слое или в присутствии некоторых цитокинов, в частности LIF. В связи с этим были начаты исследования по изучению роли цитокина LIF в регуляции и поддержании плюрипотентных свойств ЭС клеток мыши in vitro. Эти исследования необходимы для выявления роли цитокина в процессах регуляции межклеточных взаимодействий и генетической стабильности.
Для проведения трансформации геном lif использовали плазмиду pcDNA3, несущую кодирующую последовательность гена lif мыши, и ген пео (ген неомицинфосфотрансферазы), обеспечивающий устойчивость к антибиотику G418 (производное неомицина). Трансформацию клеток R1 проводили с помощью метода электропорации. Трансформированные геном lif клоны были способны развиваться в культуре, при переносе их на подложку из желатины, с последующей селекцией на выживаемость в среде с высоким содержанием G418. Массовая гибель после трансформации наблюдалась на 3-й сутки культивирования. У трансформированных клеток R1 обнаруживается низкий уровень пролиферативной активности. В селективной среде с G418 клетки формируют небольшие плоские колонии без
297
признаков морфологической дифференцировки в течение 10 дней. При окрашивании на выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы G418 резистентные клоны дают положительную реакцию. По морфологии колоний можно говорить о том, что сама процедура трансформации, по-видимому, не сопряжена с потерей плюрипотентности ЭС клеток.
Для детектирования уровня экспрессии гена lif устойчивые к G418 клоны клеток линии R1 были проанализированы методом РТ-ПЦР, с использованием соответствующих праймеров (5GGGCCTCCTCAGCAATGTGC3 и 5GCCCAGCCCAGAGTGCAGTG3). Было показано, что экспрессия гена lif обнаруживается в клонах с видимыми признаками морфологической дифференцировки. Возможно, что высокий уровень эндогенного LIF в трансфицированных клетках тормозит их пролиферативную активность и способствует переходу в дифференцированное состояние (Федченко и др., 2001).
Необходимость применения фидерного слоя при культивировании ЭС клеток связано с продукцией LIF клетками первичных эмбриональных фиб-робластов, которые обеспечивают достаточный уровень концентрации этого фактора в непосредственной близости от ЭС клеток. Попытка стабилизировать плюрипотентные свойства ЭС клеток мыши линии R1 путем трансформации их геном /// подтверждает его участие в процессах раннего развития и дифференцировки.
В. Дифференцировка ЭС клеток in vitro. Одним из основных признаков ЭС клеток in vitro является их способость дифференцироваться с образованием эмбриоидых тел различной сложности, которые представляют собой зачатки всех трех зародышевых листков. Дифференцировка ЭС клеток может происходить как спонтанным путем, так и под действием некоторых химических реагентов и ростовых факторов. Известно, что активин А и трансформирующий фактор роста бетта (TGF-1) индуцирует дифференцировку клеток мезодермального происхождения соматических мышечных и кардио-миоцитов. Другая группа факторов - ретиноевая кислота, фактор роста фибробласгов (FGF) и эпидермальный фактор роста (EGF) - направляет дифференцировку мезодермальных и эктодермальных клеток. Наконец, фактор роста нервов (NGF) и фактор роста гепатоцитов (HGF) участвуют в развитии всех трех эмбриональных листков, их воздействие приводит к появлению клеток печени и поджелудочной железы, мышечных, хрящевых, кроветворных и нейрональных клеток (Rohwedel et al., 1994; Bain et al., 1995; Shuldiner et al., 2000). Интересно отметить, что при разных концентрациях ретиноевой кислоты можно добиться преимущественной дифференцировки, либо в нейрональном, либо в миогенном направлении. Исследования генетического контроля миогенной и эпителиальной дифференцировки ЭС клеток показало, что последовательность экспрессии тканеспецифических генов такая же, как и в процессе нормального развития (Rohwedel et al., 1994; Bagutti et al., 1996).
Существует ряд фактов, указывающих, что некоторые клеточные про-то- и онкогены принимают определенное участие в пролиферации и диффе-ренцировке клеток. Действие ТФА (12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат), стимулирующего дифференцировку клеток нейробластомы человека, одновременно повышает активность c-src (Bjelfman et al., 1990). Микроинъекция мутантного онкогена c-Ha-ras в клетки феохромоцитомы крысы PC-12 вызывает их дифференцировку и появление нейроноподобных клеток (Ваг-
