Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
298
Sagi, Feramicko, 1985). Однако в этих работах использовались злокачественные клетки, поэтому представляет интерес исследовать возможность индуцировать дифференцировку нормальных плюрипотентных стволовых клеток путем воздействия на них клеточных прото- и онкогенов.
Одной из задач наших исследований явилось проведение ср авнительного анализа действия регуляторных генов вируса иммунодефицита человека ти -па 1 tat и nef па пролиферацию и дифференцировку ЭС клеток мыши in vitro. Продукты генов tat и nef имеют противоположное влияние на клеточные гены. Ген tat, обладая онкогенным потенциалом, активирует транскрипцию некоторых клеточных генов и повышает пролиферацию клеток. Ген nef, подавляет экспрессию отдельных клеточных генов, и снижает рост клеток, вместе с тем кооперирует с геном tat при образовании фокусов трансформации (Шугурова и др, 1997, 2000). Более подробно функции этих генов рассмотрены в обзоре В.З. Тарантула в этой книге. Для проведения этих исследований была отработана методика получения эмбриоидных тел в линии R1. При культивировании клеток RI в суспензии на 2-3-и сутки они образовывали плотные шарообразные агрегаты, называемые простыми эмбриоидными телами. При дальнейшем культивировании эмбриоидные тела увеличиваются в своих размерах и усложняются в строении (рис. 107,а). При переносе эмбриоидных тел на подложку с желатиной, они прикрепляются к субстрату, происходит миграция клеток из эмбриоидного тела по поверхности и их дифференцировка в различные клеточные типы (рис. 107,б). В результате проведенных экспериментов показано, что эффективность образования эмбриоидных тел клетками линии R1 зависит от количества клеток, высеваемых на поверхность чашки без фидерного слоя, способных образовывать эмбриоидные тела и времени культивирования эмбриоидных тел до начала дифференцировки.
Известно, что бутират натрия вызывает ряд эффектов на клетках млекопитающих в культуре, включая снижение репликации ДНК, которая приводит к остановке деления клеток, изменению морфологии клеток, изменению уровня экспрессии некоторых генных продуктов. Показано, что бутират натрия индуцирует дифференцировку клеток тератокарциномы (Казака et al., 1991). Нами были проведены эксперименты по спонтанной дифферен-цировке, а также под влиянием бутирата (1 мМ) в клетках R1. Обнаружено появление кластеров сокращающихся клеток, предположительно кардио-миоцитов, на 2-3-и сутки, после прикрепления к подложке эмбриоидных тел. Время развития сокращающихся клеток in vitro колеблется от 2 до 10 сут. Частота пульсации этих клеток также менялась в зависимости от времени после посева эмбриоидных тел. В первые сутки частота не превышала 60 сокращений в минуту, затем она снижалась (Гордеева и др., 2001; Мануйлова и др., 2001). Очевидно, способность ЭС клеток к дифференцировке in vitro является уникальной моделью для исследования процессов клеточной дифференцировки в разных типах тканей. Особенно важно, что эта клеточная система обладает способностью к направленной дифференцировке при воздействии эндогенных и экзогенных факторов. В связи с этим мы проводили исследование по изучению влияния регуляторных генов вируса иммунодефицита человека типа 1 tat и nef на пролиферацию, морфологию и дифференцировку ЭС клеток мыши. Для проведения трансфекции ЭС клеток линии R1 использовали следующие рекомбинантные плазмиды; pTat, содержа-
299
А
Ь
nef
Е. coli Ori
SV40 pol
AmpR
E. coli Ori
AmpR
Rat preproins . polyA
SV40
Ori
Puc. 108. Схема пла (миды pTat. 3,1 кб Sall/PstI-фрагмент изолята НХВ-2 HIV-1, в котором делетировав ген nef, содержит 1-й транслируемый экзон гена tat, интрон и 2-й транслируемый экзон гена tat. Ген находится под управлением промотора цитомегаловируса в векторе pcDNA3. Плазмида несет также ген устойчивости к неомицину (А); схема плазмиды pNef (любезно предоставлена S. Hammes). Плазмида содержит ген nef изолята HXD-3 HIV-1 (0,692 кб HindIII-TaqI-фрагмент) под цитомегаловирусным промотором в векторе pBC12/CMv (Б)
щую ген tat под промотором цитомегаловируса и ген пео, устойчивость к неомицину, pNef, несущую ген nef под контролем промотора цитомегаловируса. Структура соответствующих плазмид представлена на рис. 108.
Для выявления трансфектантов ЭС клеток в варианте с геном nef проводили котрансформацию с плазмидой pSV2neo. Параллельно клетки R] трансфицировали плазмидой pSV2neo и использовали как контрольные. В результате проведения трансфекции и селекции эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши получены 3 линии клеток; и еоА:- (в с к тор о м pSV2neo) контроль, /<7/-(вектором pTatneo), ие/-(вектором pNef, pSV2neo). Изменения в морфологии наблюдали только для клеток линии nef. Как видно из рис. 109, при изучении пролиферативной активности клеток всех трех выделенных линий обнаружено, что пролиферация клеток линии tat была выше, а поли-ферация клеток линии «^снижалась примерно в 1,5 раза по сравнению с контрольными клетками линии пеок (Шугурова и др., 2001).
Для изучения возможного влиния генов tat и nef на дифференцировку ЭС клеток проводили эксперименты, где определяли следующие показатели для трех линий клеток: 1) время, необходимое для формирования эмбриоид-ного тела; 2) количество сформированных эмбриоидных тел; 3) размер эм-бриоидного тела; 4) появление клеток с различной тканеспецифичностью. В результате проведенных экспериментов было показано, что время необходимое для образования эмбриоидных тел, одинаково для клеток линии пеок, tat, nef. Клетки линии пеок и nef формируют примерно одинаковое количество эмбриоидных тел - от 3 до 6 - на 3-и сутки после посева, тогда как клерки линии tat формируют в основном только одно эмбриоидное тело. Значительных различий в размерах эмбриоидных тел для этих линий не обнаружено. На 5-й день после прикрепления эмбриоидных тел клеток линии
