Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
ВВЕДЕНИЕ
Сообщение о получении культуры ЭС клеток мыши было сделано одновременно в двух работах в 1981 г. (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981). В настоящее время ЭС клетки подразделяют на три типа.
1. Клетки, изолированные из внутренней клеточной массы бластоцисты млекопитающих, именно эти клетки принято называть эмбриональными стволовыми клетками.
2. Клетки эмбриональных карцином.
3. Первичные половые клетки зародыша.
290
На рис. 102 представлена общепринятая в настоящее время схема получения ЭС клеток и их использование для получения химерных животных. В последние годы ЭС клетки используются в различных направлениях исследований. На рис. 103 приведены некоторые из таких направлений.
Кроме экспериментов по получению химерных животных и направленному изменению генов с целью изучения их функций в процессе развития и на уровне взрослого организма, ЭС клетки используются в экспериментах по клонированию животных и изучению начальных стадий эмбрионального развития in vitro. Большой интерес в последние годы вызывает направление (см. рис. 103), связанное с изучением путей направленной дифференцировки ЭС и стволовых клеток млекопитающих и, что особенно важно человека, в определенные типы клеток in vitro. Способность управлять этими процессами позволит в перспективе использовать такие клетки в заместительной терапии различных тяжелых заболеваний человека, таких как нейродегенера-тивные, онкологические и др.
ЭС клетки обладают высокой пролиферативной активностью и способностью в течение длительного времени в культуре поддерживаться в недифференцированном состоянии. Для сохранения недифференцированного фенотипа ЭС клеток в культуре требуется наличие фидерного слоя, который может быть представлен первичными эмбриональными фибробласта-ми или перевиваемыми фибробластами мыши линии STO (Evans, Kaufman, 1981).
На рис. 104 показан рост ЭС клеток на фидерном слое эмбриональных фибробластов мыши. Другой метод предупреждения дифференцировки ЭС клеток включает добавление в культуральную среду в отсутствие фидера LIF (фактор, ингибирующий лейкемию), который представляет собой гемо-поэтический регулятор, индуцирующий дифференцировку клеток миелоид-ной лейкемии линии Ml. Успешно используются и ряд других цитокинов для сохранения недифференцированного состояния ЭС клеток: интерлейкин-6 (Nichols et al., 1994), онкостатин (Rose, Bruce, 1994), цилиарный нейротрофи-ческий фактор (CNTF) (Conover et al., 1993). В качестве методических приемов предупреждения дифференцировки ЭС клеток используются: добавление в среду LIF в присутствии фидерного слоя (Nichols et al., 1990), фидерные клетки, трансформированные рекомбинантным вектором и экспрессирующие LIF (McMahon, Bradley, 1990), и применение рекомбинантного LIF в отсутствие фидерного слоя (Pease et al., 1990).
Все описанные линии ЭС клеток мыши сходны по своим морфологическим характеристикам. Клетки имеют крупное ядро, содержащее преимущественно эухроматин и несколько ядрышек. Для них свойственно высокое ядерно-цитоплазматическое отношение: цитоплазма представлена узким ободком, окружающим ядро. Клеточный цикл 18—20 ч, Орфаза очень короткая (Rohwedell et al., 1994). Кариотипический анализ 35 линий ЭС клеток показал, что 25 из них имеют кариотип ХУ, а остальные ХО и XX (Robertson, Bradley, 1986). Авторы полагают, что ЭС клетки предпочтительней образуются из клеток с мужским кариотипом, поскольку вторая Х-хромосома может явиться дестабилизатором плюрипотентности. В основном все ЭС клетки имеют нормальный кариотип 2п = 40, изменения в кариотипе могут приводить к потере плюрипотентности (Миталипов и др.,
1994).
10*
291
изоляция ВКМ из бластоцисты
ЭС клетки в культуре
инъекция бластоцист *
трансплантация
ложнобеременной
самке
химерное
потомство
Germ-line
трансмиссия
трофэктодерма
внутренняя клеточная масса (ВКМ)
дифференцировка ЭС клеток
кариотипическии анализ ЭС клеток
вазоэктомированныи самец
Рис. 102. Схема получения ЭС клеток и их использование при изучении процессов направ к ипой дифференцировки в системах in vitro и in vivo, а также при создании трансгенных животных
Особенностью ЭС клеток является высокая активность эндогенной щелочной фосфатазы. Методом количественного анализа было установлено, что активность эндогенной щелочной фосфатазы стволовых клеток терато-карцином, внутренней клеточной массы бластоцисты, эпибласта 5-6-дневного эмбриона, первичных половых клеток в 10 раз превышает таковую у дифференцированных соматических клеток (Wobus et al., 1984; Дыбан, 1988). Для ЭС клеток характерен также высокий уровень теломеразной активности, который коррелирует со степенью недифференцированности ЭС клеток (Thomson et al., 1998; Yeager, Reddel, 1999). Сохранение недифферен-
292
Рис. 103. Основные направления исследований, в которых в настоящее время используются эмбриональные стволовые клетки млекопитающих
цированного фенотипа ЭС клеток в культуре может быть подтверждено использованием антител к специфическим поверхностным антигенам ЭС, таких как ЕСМА-7, SSEA-1 (Kemler et al., 1979).
