Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
294
тации произошло выключение изучаемых генов. Анализ мышей, гомозиготных по им//-аллелям, выявил несколько типов фенотипического проявления индуцированных мутаций:
1. Летальный эффект в эмбриогенезе или сразу после рождения.
2. Нарушение развития, функций, морфологии различных органов и гибель до наступления половой зрелости.
3. Нормальное развитие, жизнеспособность, плодовитость, отсутствие отклонений от нормы.
Например, в случае эмбриональных деталей происходит инактивация таких генов, как: nfl, Rb, N-myc, GAP, c-jun, c-myb. Гибель после рождения наблюдается при выключении следующих генов; c-abl, BDNF, trk, N-myc, TGF-3. Инактивация генов: CNTF, DIx-2, FNAR-1, Ki-ras, c-mos, АТ-2 приводит к нарушению развития, функций и морфологии разных органов. Нормальное развитие без изменения жизнеспособности, плодовитости наблюдали при инактивации таких генов, как: ароЕ, N-ras, MyoD, pim-1, c-fos. Очевидно, в этих случаях функции определенных генов могут выполняться другими родственными генами.
Стратегия генного таргетинга позволяет изучать функции отдельных генов как в развитии, так и во взрослом состоянии и моделировать на животных (мышах) наследственные аномалии, встречающиеся у человека, с целью исследования их патогенеза и фенотипического проявления.
В настоящее время методы выделения ЭС клеток разработаны для разных видов животных: свиньи, овцы, коровы, норки, кролика и хомячка. В 1998 г. появилось два сообщения о выделении ЭС клеток человека из бластоцист (Thomson et al., 1998) и из первичных половых клеток зародыша (Shamblott et al., 1998). Несмотря на широкое распространение линий ЭС клеток и их интенсивное использование в экспериментах, остается еще достаточно много вопросов по вопросам их культивирования и дифференцировки. В настоящей работе (см. раздел “Основная часть”) представлены результаты экспериментов по морфологической характеристике начальных стадий эмбрионального развития, влиянию продуктов некоторых генов на пролиферацию и дифференцировку этих клеток в культуре, а также данные по таргетингу гена, кодирующего фактор роста фибробластов (PDGF-A).
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
А. Характеристика эмбриональных стволовых клеток мыши. Отсутствие экспериментальных подтверждений бессмертности ЭС клеток и сложность их культивирования послужили основанием для проведения исследований по выявлению и поддержанию плюрипотентных свойств, отличающих эмбриональные клетки от соматических клеток культуры тканей. В настоящей работе были использованы две линии ЭС клеток мыши D3 и R1, обе линии выделены из бластоцист линии мышей 129/Sv (Doetschman et al., 1985, Nagy et al., 1993). Одним из основных критериев плюрипотентности ЭС клеток принято считать форму колоний (Doetschman et al., 1985). Однако этот показатель во многом носит условный характер. По форме колоний иногда трудно отличить истинно эмбриональные клетки от клеток, спонтан-
295
Рис. 105. Ультраструктура ЭС клетки. Х5800
Видно крупное ядро клетки, а также эндоплазматический ретикулум (а) и митохондрии (б)
но трансформированных в эмбриональную карциному. При фидерном способе культивирование формируются монослойные колонии округлой или удлиненной формы, с четко выраженными краями по периферии. Диффе-ренцировка ЭС клеток приводит к морфологической гетерогенности и появлению колоний с неровными краями и тенденцией к вертикальному росту. Исследования ультраструктуры ЭС клеток показали, что клетки имеют относительно крупное ядро, содержащее преимущественно эухроматин, одно или два ядрышка, в которых доминируют гранулярные компоненты. В отличие от общепринятых представлений о том, что ЭС клетки лишены большинства органелл (Doetschman et al., 1985; Robertson. Bradley, 1986), в их цитоплазме были обнаружены многочисленные свободные рибосомы, шероховатый эндоплазматический ретикулум представлен единичными цистернами, что свидетельствует о низком уровне синтетической активности, комплекс Гольджи, около которого располагались 1-2 центриоли, митохондрии и многочисленные лизосомы (рис. 105).
296
Аналогичная ультраструктура была выявлена в ранних мышиных зародышах на стадии бластоцисты. Клетки внутренней клеточной массы и ЭС клетки прошедшие, в культуре несколько пассажей, на ультраструктурном уровне имели большое сходство, что свидетельствует об общности их происхождения.
Были обнаружены небольшие межлинейные различия в пролифератив-ной активности и способности к дифференцировке, что, возможно, определялось генетической принадлежностью и возрастом ЭС клеток, т.е. количеством пассажей.
В популяции ЭС клеток преобладали клетки среднего размера (10-12 мкм). Они обладали адгезивными и пролиферативными свойствами, при контакте с фидером давали нормальные по внешнему виду монослой-ные колонии, а также были способны к дифференцировке в эмбриоидные тела. Более мелкие (до 10 мкм) и более крупные (свыше 15 мкм), оставались не прикрепленными к субстрату и через некоторое время погибали или формировали колонии дифференцированных клеток. При этом морфологическая дифференцировка сопровождалась увеличением продолжительности стадии метафазы, а также частоты анеуплоидных и полиплоидных клеток и их гибели по механизму апоптоза.
