Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
При определенных условиях культивирования (в суспензионном состоянии) ЭС клетки формируют эмбриоидные тела, которые представляют собой зачатки эндодермы, эктодермы и мезодермы, напоминая постимпланта-ционное эмбриональное развитие. Если эмбриоидные тела прикрепляются к субстрату, то клетки, формирующие внутренние слои таких тел, способны в дальнейшем дифференцироваться в широкий спектор тканей, такие как мышечная, нервная, эпителиальная и др. Способность ЭС клеток к дифферен-цировке in vitro используется как модель для исследования процессов клеточной дифференцировки в разные типы тканей.
После инъекции ЭС клеток в бластоцисты они способны участвовать в образовании всех тканей, включая и линии зародышевых клеток химерного организма. Способность ЭС клеток дифференцироваться in vivo оценивается по частоте химер и степени колонизации тканей химерного потомства, а также по частоте генеративных химер. Это свойство клеток в сочетании с методом гомологичной рекомбинации, которая позволяет направленно изменять геном ЭС клеток, дает возможность создавать трансгенных животных с заданным (измененным) генотипом (см. рис. 102).
В 1982 г. впервые было показано, что соматические клетки млекопитающих обладают ферментативным механизмом, способным осуществлять гомологичную рекомбинацию между хромосомной и экзогенной ДНК, введенной в соматические клетки (Folger et al., 1982). Частота гомологичной рекомбинации достаточно низкая и в зависимости от локуса может быть от 10_3 до 10 7. Существует две возможности для гомологичной рекомбинации между экзогенной (вектор) и геномной (мишень) последовательностями ДНК: замещение и внедрение. В случае замещения происходи^ двойной кроссинговер между гомологичными последовательностями вектора и гено-
293
ма, в случае внедрения происходит простой кроссинговер. Замещение приводит к инактивации гена, т.е. к его “нокауту”.
В перрых экспериментах на ЭС клетках для таргетинга был избран ген hprt. Ген hprt локализован на Х-хромосоме, поэтому мужские ЭС клетки ге-мизиготны по hprt и достаточно инактивации только одной копии гена для получения селективного фенотипа. Нрч мутанты могут расти в среде, содержащей аналог пурина, 6-тиогуанин, тогда как клетки, имеющие нормальный фермент, на этой среде не растут (Thomas, Capecchi, 1987). Этими авторами впервые был сконструирован вектор, в котором бактериальный ген пео (нео мицинфосфотрансферазы), обеспечивающий устойчивость к антибиотику G418, вставлен в восьмой экзон клонированного фрагмента гена hprt. Двойная резистентность клеток (G4J8, 6TG) свидетельствует о гомологичной рекомбинации, приводящей к разрушению гена. Было показано, что одна гомологичная рекомбинация происходит на 1000 случайных интеграций. В данной работе сам таргетируемый ген являлся селективным маркером. Для таргетирования неселективных генов был разработан метод позитивнонегативной селекции (Mansour et al., 1988). Вектор для таргетинга содержит позитивный селективный маркер (пео) и негативный маркер - ген тимидин-киназы (tk) вируса герпеса HSV, которые расположены в разных местах вектора и каждый имеет свой промотор. Гомологичная рекомбинация с таргетированным геном приводит к встраиванию гена пео и элиминации гена tk, а негомологичная рекомбинация к встраиванию в хромосому обоих маркеров. Селекция гомологичных рекомбинатов проводится на среде, содержащей G418 и противовирусный препарат ганцикловир. Ганцикловир способен фосфорилироваться герпесной тимидинкиназой (в отличие от клеточной) и при последующем встраивании в ДНК при репликации приводит к гибели клеток, экспрессирующих эту тимидинкиназу. Ген tk присутствует в клетках при случайном встраивании вектора и отсутствует в клетках, претерпевших гомологичную рекомбинацию. Таким образом последние селектируются, будучи пео- и ганцикловир-резистентными, тогда как клетки, включившие вектор путем случайной интеграции, будут и(?о-резистечтны, но ганцикловир чувствительны. Другим геном, обеспечивающим отрицательную селекцию, является фрагмент гена дифтерийного токсина, кодирующего его A-цепь (ДТ-А). Продукт этого гена токсичен для эукариотических клегок за счет ингибирования синтеза белка. Если ген ДТ-А встраивается в геном вместе с вектором и экспрессируется, то происходит гибель клетки (Yagi et al., 1990).
Существует еще ряд подходов для выявления клонов ЭС клеток. Более подробную информацию об этих подходах можно найти в соответствующем обзоре (Тарантул, 1996). Одним из важных факторов, влияющих на частоту гомологичной рекомбинации, является степень гомологии между хромосомной и экзогенной ДНК (Те Riele et al., 1992.). В основном все линии ЭС клеток, которые используются для таргетинга, выделены из линии мышей 129Sv. В связи с этим в работах по гомологичной рекомбинации вектора конструируют на базе генов, клонированных из банка генов этих линий мышей.
Использование ЭС клеток в сочетании с методом гомологичной рекомбинации открыло новые возможности для направленного мутагенеза. В основном, в большинстве работ получены мыши, у которых в результате му-
