Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
300
пеок к подложке появились участки сокращающихся клеток-кардиомиоци-тов, что было подтверждено результатами иммуноцитохимического анализа. Количество эмбриоидных тел с сокращающимися кардиомиоцитами увеличивалось в клетках линии пеок в течение 5 дней. В клетках линии nef кар-диомиоциты появились только на 10-й день после прикрепления эмбриоидных тел к подложке, их количество заметно не увеличивалось в период проведения эксперимента (10 дней). В эмбриоидных телах, сформированных клетками линии tat не было обнаружено появление кардиомиоцитов в течение 10 дней наблюдения. Результаты представленных экспериментов позволяют сказать, что под влиянием гена tat наблюдается тенденция повышения пролиферативной активности ЭС клеток мыши и ее подавление под влиянием гена nef, что согласуется с данными, полученными на клетках крысы двух линий: псевдонормальных клетках Rat-2 и клетках феохромоцитомы PC-12 (Шугурова и др. 1997, 2000). Полученные данные также позволяют предположить, что регуляторные гены ВИЧ-1 tat и nef могут оказывать влияние как на ранние стадии дифференцировки ЭС клеток (на уровне эмбриоидных тел), так и на процесс дифференцировки этих клеток в кардиомиоциты.
Разработка методов направленной тканеспецифической дифференцировки, помимо теоретического значения для изучения молекулярных механизмов клеточной дифференцировки, имеет и прикладное значение, такие клетки в перспективе могут быть использованы в клеточной терапии и трансплантации у человека.
Для изучения путей дифференцировки ЭС клеток в разные типы клеток in vivo используются подходы по пересадке таких клеток в различные органы взрослых животных (мозг, печень, селезенка и т.д.) с последующей регистрацией судьбы этих клеток. Для объективного обнаружения пересаженных клеток необходимо иметь “маркированные” линии ЭС клеток. Нами были получены линии ЭСК, трансфицированные геном “зеленого белка”. Такие клетки легко детектируются на срезах органов и тканей с помощью флуоресцентной микроскопии. На рис. 110 показаны ЭС клетки линии R1, трансфицированные плазмидой, содержащей ген “зеленого белка”.
Проведенные нами совместно с Институтом биологии гена РАН и Институтом биологии развития РАН по пересадке “зеленых клеток” в различные отделы мозга крысы, показали, что такие клетки могут сохранять жизнеспособность в чужеродном организме не менее одной недели.
Г. Гомологичная рекомбинация в ЭС клетках мыши. В нашем отделе была проведена работа по нокаутированию гена PDGF-A в ЭС клетках мыши и получению на основе этих клеток химерной мыши (Макарова и др.,
1997).
PDGF-A- белок, фактор роста тромбоцитов. Существует три типа димеров PDGF: АА, АВ и ВВ, состоящих из двух полипептидных цепей - PDGF-A и PDGF-В, которые кодируются двумя различными генами. Эти гены являются гомологичными и кодируют длинную и короткую формы PDGF, получающиеся путем альтернативного сплайсинга. В свою очередь существует 3 вида рецепторов для PDGF, кк и кк, также состоящих из полипептидов -PDGFR и PDGFR, кодируемых разными генами. Митогенная активность PDGF реализуется при его взаимодействии с рецептором, при этом PDGFR-a может связываться как с А-, так и с В-цепью PDGF, a PDGFR - только с В-цепью (Bowen-Pope et al., 1991). Основным местом синтеза PDGF являют-
301
А %
1
Б
' ?
1
Г
Д
1 т.п.н.
Рис. 111. Схема строения гена PDGF-A, вектора, использованного для таргетинга (Б), и мутантного гена PDGF-A со встроенной в его 3-й экзон PGК-иео-кассетой (В). Г - НашПИ-фраг-мент гена PDGF-A дикого типа, Д - Hindlll-фрагмент гена. DT-A - кассета с геном субъединицы А дифтерийного токсина. PGK-neo-касс ста с геном неомицинфосфотраь>.фера i под промотором гена фосфоглицерокиназы
Зонд отмечен линией под А. Заштрихованными и нумерованными прямоугольниками изображены экзо-ны гена PDGF-A, а линиями между ними - интроны. Стрелками указаны направления транскрипции генов. Сайты рестрикции: Н - Hindlll, А' - Kpnl, В - BamHI, Z - EcoRl, Mr - Ncol
ся тромбоциты, хотя в незначительных количествах они синтезируются в эндотелии, моноцитах и макрофагах, гладкой мускулатуре, фибробластах, цитотрофобластах плаценты, нейронах и в [лии. В большинстве клеточных типов экспрессия PDGF происходит при функциональной или митогенной активации, хотя в мегакариоцитах и нейронах она, по-видимому, конститутивна. По некоторым данным, помимо митогенной активности, PDGF принимает участие в процессах дифференцировки, хемотаксиса, в регуляции синтеза компонентов межклеточного матрикса (Bowen-Pope et al., 1991; Grotendorst et al., 1992; Heldin, 1992). Обнаружена экспрессия PDGF и рецепторов к этим ростовым факторам как на самых ранних, доимплантацион-ных, стадиях эмбрионального развития, так и при дифференцировке мезенхимы и нервной ткани (Adamson, 1993) PDGF продуцируют также многие опухоли, такие, например, как глиобластомы, нейробластомы, меланомы и остеосаркомы.
Вектор замещения для таргетинга конструировали на основе гена PDGF-A, проклонированного из библиотеки генов линии мышей 129Sv (рис. 111).
На рис. 111 представлены этапы конструирования и окончательная структура соответствующего вектора. Этот вектор включал в себя фрагмент, содержащий экзоны 3 и 4. В экзон 3 был вставлен ген пео, обеспечивающий устойчивость к антибиотику неомицину (G418). В качестве промотора гена пео использовали промотор гена фосфоглицерокиназы (PGK-иео-кассета). Для проведения негативной селекции против случайного встраивания в ге-
