Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Специфические однотипные перестройки в структуре трансгена наблюдали у трансгенных мышей с геном, кодирующим белок оболочки вируса гепатита В под контролем раннего промотора вируса SV40. Вместе с тем в печени одной из трансгенных мышей были выявлены транскрипты гена, что указывало на то, что по крайней мере в некоторых трансгенных мышах ранний промотор вируса SV40 функционировал в высокодифференцированных клетках (гепатоцитах) (Андреева и др., 1987).
Удобным для изучения структуры трансгена и фланкирующих последовательностей стал метод “спасения плазмиды”. С помощью этого метода нами была клонирована встроенная в геном одной из линий трансгенных мышей рекомбинантная плазмида с геном /A.-HSV под контролем LTR провиру-
7*
195
ca RSV. Оказалось, что в “спасенной” плазмиде отсутствовали все вирусные последовательности и сохранились только участки плазмиды pBR322, ответственные за репликацию плазмиды и устойчивость клеток Е. coli к ампициллину (Тарантул и др., 19866; Tarantul et al., 1986).
ВЛИЯНИЕ МИКРОМАНИПУЛЯЦИЙ С РАННИМИ ЗАРОДЫШАМИ НА ИХ РАЗВИТИЕ
Многие репродуктивные биотехнологии, применяемые в животноводстве и медицине, используют различные манипуляции с половыми клетками и эмбрионами ранних стадий развития. Достаточно перечислить такие из них, как трансплантация зародышей приемным реципиентам, искусственное получение близнецов путем рассечения зиготы, клонирование, получение химер, трансгеноз, замораживание и длительное хранение спермы или яйцеклеток и экстракорпоральное оплодотворение у человека. Отдаленные последствия таких манипуляций недостаточно изучены.
Имеются многочисленные сведения, указывающие на высокую смертность эмбрионов в экспериментах с трансгенозом, появление разнообразных фенотипических эффектов не только у трансгенных животных, но и у нетрансгенных однопометных сибсов и т.д. В связи с этим нами были изучены онкологические последствия внедрения в геном чужеродных генов и неспецифического повреждающего действия манипуляций при получении трансгенных мышей (Серова и др., 1991). В качестве трансгена использовали фрагменты ДНК аденовируса SA7 обезьян. Анализ более трех сотен мышей, родившихся из гибридных зигот (Balb/c х DD)F,, микроинъецирован-ных чужеродной ДНК или контрольным буфером независимо от того, являлись они трансгенными или нет, показал, что статистически достоверно поьышалась частота возникновения опухолей; при этом нозологическая характеристика опухолей подопытных мышей была значительно разнообразнее, чем в контроле. Так, помимо существенного возрастания частоты опухолей, характерных для этих гибридов (аденокарцинома молочной железы и легкого), выявлены опухоли печени, желудочно-кишечного тракта, системы гематопоэза, кожи, органов мочеполовой системы и мягких тканей.
В последующей серии экспериментов, направленных на изучение неспецифического повреждающего действия микроманипуляционной техники на потомство, зиготы линейных и гибридных мышей (C57BL и (BALB/c х DD)F,) подвергали следующим манипуляциям: 1) инкубации в культуральной среде, 2) проколу стеклянной микроиглой мужского пронуклеуса, 3) инъекции буферного раствора и 4) инъекции ДНК (гена р53 мыши с промотором гена инсулина человека) в мужской пронуклеус. Обнаружено, что все эти манипуляции вызывали внутриутробную гибель эмбрионов, появление значительного количество мертворожденных и нежизнеспособных потомков с многочисленными аномалиями развития. Статистический анализ показал, что наиболее травматичным этапом микроманипуляционной техники являлся прокол пронуклеуса зигот, поскольку последствия этого повреждения были выше, чем при инкубации зигот, и сопоставимы с результатами микроинъекции буфера и ДНК (Андреева, Серова, 1992; Серова и др., 1998).
196
Полученные нами результаты согласуются с некоторыми данными зарубежных исследователей, работающих в области экстракорпорального оплодотворения человека с помощью метода ICSI (Ludwig, Ditrich, 2000). Осторожно следует относиться и к таким манипуляциям с человеческими эмбрионами, как пересадка ядер в целях клонирования клеточных культур в терапевтических целях, так как исследования в этой области только начинаются, а их последствия могут оказаться непредсказуемыми.
ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
И ИХ ФУНКЦИИ
Трансгенные животные получили широкое распространение в экспериментах по изучению молекулярных механизмов регуляции экспрессии различных генов и определению их биологической функции.
В продолжение цикпа работ по биологическому эффекту ГГР и гена ри-лизинг-фактора гормона роста, проведенным на мышах (см. выше), нами были получены трансгенные кролики с геном рилизинг-фактора гормона роста человека под МТ-промотором. При интенсивной экспрессии этого трансгена в печени достоверно происходило увеличение веса тела у животных на 10% (Газарян и др., 1989). Исследование уровней ряда гормонов показало, что в крови трансгенного кролика были в несколько раз повышены уровни инсулина, тироксина, трийодтиронина. Отмечен низкий уровень со-матостатина и снижены в 2-4 раза уровни лютеинизирующего гормона, прогестерона и тестостерона (Коваль и др., 1991).
