Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
СПИД
На трансгенных мышах были проведены многочисленные работы по изучению функций отдельных генов HIV и получению модели такого заболевания человека, как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Выше мы уже останавливались на результатах наших исследований функции двух регуляторных генов HIV с использованием трансгенных животных. Наличие у мышей единичных вирусных генов воспроизводит некоторые патологии, присущие СПИДу, но не позволяет создать модель этого заболевания. С самого начала было очевидно, что для решения данной задачи необходимо получать трансгенные организмы, содержащие целый или почти целый геном вируса. Вместе с тем, даже когда были получены такие трансгенные мыши, они не стали адекватной моделью СПИДа (Dickie et al., 1991). Хорошая модель появилась лишь десять лет спустя, когда в качестве объекта для переноса генома HIV были использованы крысы (Reid et al., 2001). Неудача в случае использования трансгенных мышей объяснилась тем, что у мышей, в отличие от крыс, циклин Т, являющийся кофактором, не взаимодействует функционально с вирусным белком Tat. Такие ограничения не-
204
обходимо учитывать при создании и других моделей болезней человека. Это важно также для использования трансгенных животных в фармакологических и токсикологических исследованиях. С этой целью осуществляют процесс “хьюманизации” организмов, т.е. создают с помощью трансгеноза животных со специфическими рецепторами или антигенами человека, которые в норме у них отсутствуют. В частности, в настоящее время получены трансгенные модели с человеческими генами рецептора интерлейкина 6, антигена CD4, рецептором иммуноглобулина Е и др. (Kirkland, Muller, 2000).
МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ ПАТОЛОГИИ
Недавно появились сообщения о переносе целой экзогенной митохондриальной ДНК (мтДНК) в эмбрионы мышей. Цитопласты (энуклеирован-ные клетки), несущие в мтДНК мутацию, связанную с энергетическим метаболизмом, сливали с ЭСК с инактивированными митохондриями. Затем эти ЭСК использовали для получения химер (см. Эмбриональные стволовые клетки и таргетинг генов). В результате химерные мыши и их потомки имели ряд аномалий, сходных с клиническими проявлениями болезни человека, обусловленной аналогичной мутацией в мтДНК (Hirano, 2001).
ЭКСТРАХРОМОСОМНЫЕ ТРАНСГЕНЫ
Изредка обнаруживалось, что переносимая экзогенная ДНК не интегрирует с геномом клеток хозяина, а персистирует и передается по наследству в экстрахромосомной форме. Внехромосомно локализованные трансгены обычно получают с использованием плазмид, которые содержат функциональные элементы ДНК-содержащих вирусов, обеспечивающие автономную репликацию трансгена в реципиентных клетках.
Цикл исследований по изучению экстрахромосомных трансгенов был проведен в нашей лаборатории на модели трансгенного тутового шелкопряда (подробнее эти данные рассмотрены в настоящем сборнике в обзоре Николаева А.И.). Рекомбинантные плазмиды, не обладающие в принципе способностью к автономной репликации, инъецировали в грены тутового шелкопряда. Из ДНК трансгенных насекомых с помощью метода “спасения плазмиды” был клонирован стабильный экстрахромосомный трансген, названный рг8а и состоящий из фрагментов бактериальной плазмиды pBR322 (она присутствовала в инъецированной рекомбинантной плазмиде) и клеточной ДНК тутового шелкопряда (Николаев и др., 1992; 1993; Nikolaev et al., 1993). Эта плазмида образовалась in vivo в результате негомологичной рекомбинации в Е0-поколении трансгенных насекомых и передавалась по наследству, по крайней мере, до поколения F4.
Плазмиду рг8а после ее “спасения” из трансгенных насекомых инъецировали в зиготы мышей с целью изучения ее поведения в организме млекопитающих (Николаев и др., 1998). У трансгенных животных нуклеотидные последовательности, гомологичные последовательности плазмиды рг8а, также обнаруживались преимущественно во внехромосомной форме. Как и в клетках тутового шелкопряда, структура трансгена у трансгенных мышей изменялась в процессе его переноса и при передаче по наследству. Последо-
205
вательно возникающие делеции в экзогенной ДНК имели сходный характер у разных особей, что указывает на существование каких-то общих механизмов рекомбинации, участвующих в “адаптации” трансгена к хозяйской системе репликации. Частичное секвенирование нуклеотидной последовательности данной плазмиды показа по, что она содержит области гомологии с отдельными повторяющимися элементами генома человека. Сравнение этой последовательности с известными ранее элементами вирусных и клеточных ДНК, обеспечивающими начало репликации (ori), указывает на существенное сходство с некоторыми из них. Область гомологии с ori-элементами перекрывается с участком рг8а, сходным с ретранспозоном L1 человека.
ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
И ТАРГЕТИНГ ГЕНОВ
Все вышеперечисленные системы получения трансгенных животных имеют тот недостаток, что вводимая этими способами ДНК интегрируется с реципиентным геномом случайным образом, зачастую в виде множества копий, часто наблюдаются перестройки трансгена, мутации в геноме хозяина вплоть до летальных (Jaenisch et al., 1983). Вследствие этого нередко экспрессия одного и того же трансгена может варьировать в широких пределах у трангенных животных до полного ее отсутствия. Однако в последнее десятилетие техника введения чужеродной ДНК в геном животных усовершенствовалась так, что стало возможным осуществлять направленное введение ДНК в любую желаемую часть генома или конкретного локуса (Тарантул,
