Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
1996).
Основой новой технологии послужило создание эмбриональных стволовых клеток. В 1981 г. одновременно в двух лабораториях были получены первые культуры клеток, выделенных из внутренней клеточной массы бластоцист мыши (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981). Все ЭСК имеют нормальный диплоидный кариотип, обладают активностями щелочной фосфатазы и теломеразы, экспрессируют ряд других маркеров, характерных для недифференцированных клеток. Это состояние поддерживается в определенных условиях культивирования, в частности, при наличии в культуре фидерного слоя эмбриональных фибробластов и/или фактора ингибирования лейкемии LIF. При удалении последних ЭСК начинают дифференцироваться в многоклеточные агрегаты, состоящие из дифференцированных и недифференцированных клеток, называемые эмбриоидными телами (см. статью Гривен-никова и др., наст, сборник). Несколько позднее были получены культуры эмбриональных герменативных клеток (ЭГК), выделенные из первичных половых клеток мыши (Donovan, 1994). Затем были выделены линии клеток, подобные ЭСК из эмбрионов кролика, хомячка, норки, свиньи, коровы, овцы, обезьян (Prelle et al., 1999) и, наконец, в последние годы такие линии выделены из бластоцист и первичных половых клеток человека (Reubinoff et al., 2000).
ЭСК и ЭГК сохраняют высокие плюрипотентные свойства при длительном культивировании in vitro и, будучи вновь введенными в эмбрион, способны формировать химер, участвуя в развитии тканей всех трех зародышевых листков, включая образование гамет (Papaioannou, Johnston, 1993; Hogan et
206
al., 1994). Однако способность ЭСК к формированию химер и наследованию этих клеток у их потомков твердо установлена пока только для ЭСК мышей. Так, неоднократные попытки исследователей Института цитологии и генетики СОН РАН (при нашем участии) получить химерных норок после инъекции клеток, подобных ЭСК, в полость бластоцисты оказались безрезультатными (Sukoyan et al., 1992).
Недавно с нашим участием была предпринята попытка получения ЭСК козы (Матвеева и др., 2000). Трансгенные козы являются наиболее подходящими кандидатами в продуценты терапевтических рекомбинантных протеинов, и ЭСК, технология получения которых у с/х животных все еще находится в стадии разработки, могли бы служить идеальной системой для этих целей. Работа проводилась на базе государственного университета Рио-де-Жанейро (Бразилия). С целью получения ЭСК нами были использованы бластоцисты коз местной породы (штат Сеара, Бразилия). Бластоцисты помещали в соответствующие условия культивирования. В результате было выделено несколько клеточных линий: в одной из них преобладали эндодермально-подобные клетки с отрицательной активностью щелочной фосфатазы, тогда как другие представляли смесь клеток, подобных ЭСК с положительной и отрицательной активностью щелочной фосфатазы и способностью к спонтанному образованию эмбриоидных тел. В настоящее время проводится оценка плюрипотентности этих клеток (рис. 71-73).
Уникальная способность ЭСК сохранять длительное время in vitro свои плюрипотентные свойства открыла широкие возможности для различных манипуляций с их генами. Были разработаны пути и методы направленного введения чужеродной ДНК в ЭСК путем гомологичной рекомбинации с экзогенной ДНК (Тарантул, 1996; Muller, 1999). При трансформации ЭСК in vitro в результате такой рекомбинации происходит инсерция эндогенной ДНК в “ген-мишень'’. Затем, после отбора ЭСК с модифицированным геномом, их инъецируют в полость бластоцисты другой линии мышей (рис. 74) или агрегируют с зародышами более ранних стадий развития, после чего их пересаживают в матку приемной матери. Среди потомков отбирают химерных животных (рис. 75, Андреева, Языков, 1981), в результате скрещивания которых получают гомозиготных мышей. Генотип гомозигот представлен исключительно модифицированными ЭСК. Общая схема осуществления направленного изменения генов у животных приведена на рис. 76.
Данная технология позволяет получать направленные изменения в любом желаемом гене (технология “gene targeting” или “knock out”). Совокупность перечисленных выше методов можно определить как генетическую модификацию генома на уровне индивидуальных генов. Они позволили применять, по крайней мере, к мышам такие два основных генетических подхода как “от фенотипа к гену” и “от гена к фенотипу”. Это имело революционизирующее воздействие как в фундаментальных научных, так и во всевозможных прикладных исследованиях.
В первую очередь технология таргетинга внесла существенный вклад в генетику мыши и анализ различных аспектов функции генов in vivo. В результате использования таргетинга генов были созданы многочисленные трансгенные мыши с различными целенаправленными изменениями генов, начиная от точечных мутаций и кончая хромосомными перестройками. При
207
Рис. 75. Химерные мыши, полученные путем агрегации эмбрионов двух разных линий мышей
внешней простоте подхода он несет множество трудностей. Одна из них связана с дизайном вектора для гомологичной рекомбинации. В частности, нами было показано, что только один из четырех сконструированных векторов на базе гена PDGF-A (тромбоцитарный фактор роста) позволял успешно осуществлять нокаут этого гена (Макарова и др., 1997).
