Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
1993). Позже клетки, продуцирующие этот вектор, были помещены под блестящую оболочку эмбрионов коров в перивителлиновое пространство для их постоянного инфицирования, однако, это привело к множественным инсерциям трансгена и леталям (Haskell, Bowen, 1995).
Известьо, что успешная интеграция вирусного генома с хозяйским геномом происходит только в митотически активных клетках (исключение составляют лентивирусы). Предположительно разрыв ядерной оболочки является критическим моментом для транслокации преинтеграционного комплекса ретровируса в ядро клетки (Roe et al., 1993). Основываясь на этих публикациях, Чан с соавт. (Chan et al., 1998) предложили новый метод введения ретровирусного вектора в геном крупного рогатого скота, который заключался ь следующем. Ооциты, находящиеся на стадии метафазы II второго деления мейоза и не имеющие ядерной оболочки на этой стадии вплоть до образования пронуклеусов после оплодотворения, инфицировали ретровирусным вектором, сконструированным на основе MoMLTV, упакованного в оболочку, в состав которой входил гликопротеин псевдотипа вируса везикулярного стоматита G. В результате оплодотворения инфицированных ооцитов и их культивирования in vitro часть из них развилось до стадии бластоцисты. После переноса бластоцист реципиентам 4 эмбриона развились до рождения. И хотя количество животных, полученных таким путем, было ограниченным, все они (100%) оказались трансгенными и экспрессировали трансген.
Уже появилось сообщение о рождении первой трансгенной обезьяны, полученной аналогичным путем. Высокий титр вышеупомянутого вектора, содержащий в своем составе ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP) под промотором гена а-1-фактора элонгации человека, был инъецирован под блестящую оболочку ооцитов обезьян (Масаса mulatto). Оплодотворение проводили методом ICSI. Эмбрионы на стадии дробления пересаживали суррогатным самкам. 3 эмбриона развивались до рождения, один из новорожденных оказался трансгенным и экспрессировал трансген в клетках ногтей и волос (Chan et al., 2001).
Недавно предложен простой и эффективный метод получения трансгенных мышей, крыс и других животных путем инфицирования оплодотворен-
192
ных яйцеклеток с помощью рекомбинантного лентивирусного вектора. 10-100 пкл раствора данного вектора, содержащего ген GFP, вводили непосредственно под блестящую оболочку зигот мышей. 80% полученных таким образом потомков оказались трансгенными, почти у всех потомков была обнаружена экспрессия трансгена (Lois et al., 2002).
В результате прогресса в развитии трансгеноза появились возможности для крупномасштабных изменений генома, включая манипуляции с фрагментами или целыми хромосомами (Smith et al., 1995; Ramirez-Solis et al.,
1995). Последняя технология получила название хромосомная инженерия. Ей способствовала разработка подходов к созданию искусственных хромосом млекопитающих, обязательными элементами которых являются центромера, теломеры и ori репликации. Искусственные хромосомы предоставляют уникальную возможность для изучения взаимосвязи между хромосомными структурами и их функциями. Использование хромосомного трансгеноза позволяет осуществлять перенос очень больших генов и целых кластеров генов со всеми окружающими их природными генетическими элементами (Brown et al., 2000). При этом также полностью исключается негативное влияние эффекта положения на трансген. Использование нового подхода на базе эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) (подробнее об этих клетках см. далее), получившего название опосредованного микроклетками транспорта хромосом, позволило получать химерных мышей с целыми хромосомами человека или их фрагментами (трансхромосомные мыши). В частности, были получены мыши, содержащие фрагменты хромосом человека с локусами легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, которые оказались способными синтезировать специфические человеческие антитела (Tomi-zuka et al., 2000).
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ТРАНСГЕНОЗА ФОРМЫ ИНТЕГРАЦИИ ТРАНСГЕНА С ГЕНОМОМ
Первоначально казалось маловероятным, что при инъекции в зиготы может сохраняться ее целостность и осуществляться перенос генов. Однако в дальнейшем выяснилось, что это вполне возможно и процедура теперь выглядит вполне рутинно. Хотя обычно лишь небольшую часть прооперированных зигот удается превращать в трансгенные организмы, оказалось возможным генетически модифицировать практически все использованные в эксперименте виды животных. При микроинъекции в пронуклеусы экзогенной ДНК встройка трансгена происходит, как правило, в единичный участок генома в виде тандемоЕ (до 50 и более копий, расположенных чаще всего в ориентации голова-хвост) (Brinster et al., 1985). Единичные фрагменты генов удается встраивать в геном при использовании в качестве вектора ретровирусов. Изредка троисходит встраивание единичных копий и при применении других подходов. В частности, в наших экспериментах на трансгенных мышах и кроликах в ряде случаев наблюдали встройки в геном единичных генов (Tarantul et al., 1986; Газарян и др., 1989). Однако детальные механизмы внедрения экзогенной ДНК в геном клеток хозяина по-прежнему остаются неизвестными.
