Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
189
конструкция и ее модификации могут быть использованы для получения трансгенных коз, в молоке которых будет экспрессироваться лекарственный белок.
Вместе с тем с самого начала работ по трансгенозу были выявлены некоторые сложности, связанные с этой технологией. В первую очередь процедура получения трансгенных животных пока еще остается малоэффективной. Трансгенные животные часто менее жизнеспособны, чем природные особи. Имеются проблемы и со стабильностью экспрессии трансгена. Все это, а также ряд других причин, включая настороженное отношение общественности к данной проблеме, и обусловили ту ситуацию, что до сих пор трансгенные животные (в отличие от трансгенных растений) находят пока лишь ограниченное применение в практике.
НОВЫЕ МЕТОДЫ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ
Кроме традиционного (классического) способа введения чужеродной ДНК с помощью микроинъекций в пронуклеус зиготы (о чем шла речь выше), в последние 10 лет получили развитие новые системы и способы переноса генов в геном животных (рис. 64). Их развитие связано в основном с целью возможного повышения эффективности трансгеноза, что особенно важно для дорогостоящих экспериментов в области биотехнологии с/х животных. Показано, например, что эффективность получения с помощью микроинъекций трансгенных коров, по меньшей мере, в 40 раз ниже, чем у мышей (Wall et al., 1997).
Одним из таких альтернативных подходов является использование сперматозоидов в качестве векторов для привнесения чужеродной ДНК в яйцеклетку при ее искусственном оплодотворении (Lavitrano et al., 1989; Maione et al., 1998). Известно, что сперматозоиды ряда видов животных в отсутствие семенной жидкости при определенных условиях способны захватывать чужеродную ДНК. Легкость и простота использования этого метода привели к многочисленным попыткам трансформировать таким образом геном мышей, свиней, крупного рогатого скота, овец, рыб, морского ежа, насекомых, птиц, шпорцевой лягушки, моллюсков (Кузнецов и др., 1999; Chan, 1999). Однако среди различных видов животных наблюдаются значительные вариации в эффективности вхождения экзогенной ДНК в ядро сперматозоида, что приводит пока к нестабильным результатам. Успешная трансформация сперматозоидов зависит, по-видимому, от эффективности связывания ДНК с поверхностью сперматозоида и ее последующей интернализацией в ядро спермия. Интеграция ДНК в ядро может происходить значительно позже процесса оплодотворения, что приводит к высокой степени мозаицизма и невозможности передачи трансгена следующему поколению. Тем не менее есть несколько сообщений об успешной передаче чужеродной ДНК потомству после оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами, обработанными ДНК (мыши, свиньи, рыбы, коровы) (Chan, 1999). В частности, нами впервые успешно продемонстрирована экспрессия гена Р-галактозидазы (lacZ)
Е. coli под промотором цитомегаловируса человека (CMV) в 3- и 5-суточных предличинках вьюна, развившихся из икринок, оплодотворенных сперматозоидами, которые предварительно инкубировались в растворе плазмидной
190
Техника переноса
Носители ДНК
Рис. 64. Схема основных методов переноса чужеродной ДНК в геном животных
ДНК, содержащей этот ген (Андреева и др., 2003) (рис. 65). Не исключено, что совершенствование методов введения ДНК в геном животных через сперматозоиды, понимание механизмов связывания, интернализации и интеграции ДНК с ядром сперматозоидов увеличат шансы успешного применения этого метода для получения трансгенных животных. Необходимо отметить, однако, что существует опасность непреднамеренного введения экзогенного генетического материала, который может случайно находиться в окружающей среде, при использовании метода внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидов (ICSI) в клиниках по искусственному оплодотворению человека (Chan et al., 2000). Показано также, что отмывка сперматозоидов человека после инкубации в растворе с ДНК вируса папилломы человека не приводила к полному удалению экзогенной ДНК из клеток. Часть ДНК прочно связывалось со сперматозоидами и интернализовалась вместе с ними (Brossfield et al., 1999).
Еще одним подходом, дающим надежду на увеличение эффективности переноса генов, является использование в качестве векторов ретровирусов. Основное преимущество этих векторов заключается в том, что они способны эффектиьно инфицировать большое число различных клеточных типов. Общий вид вирусного вектора, используемого для трансгеноза, изображен на рис. 66. Ретровирусные векторы обеспечивают интеграцию единичной копии трансгена в эмбрионы на разных стадиях развития. Первые эксперименты, продемонстрировавшие внедрение и наследование у мышей экзогенно введенного мышиного вируса лейкемии Молони (MoMLTV), были проведены еще в середине 70-х годов прошлого века Енишем с сотрудниками
191
(Jaenisch et al., 1974; Jaenisch, 1976). Эти исследователи показали, что прямая инфекция до- и постимплантационных эмбрионов мыши, кокультивирова-ние их с клетками-продуцентами вируса или инъекция их в полость бластоцисты приводит к интеграции вектора и его наследованию. Однако из-за биологической опасности работы с ретровирусами техника введения ДНК путем прямой микроинъекции в пронуклеусы оставалась преимущественной. Развитие методов, обеспечивающих репликацию дефектных ретровирусных векторов, дало новый толчок к использованию этих векторов для создания трансгенных животных. И если первоначально внимание исследователей концентрировалось на таких традиционных объектах, как мыши и птицы (Sanes et al., 1986; Mitrani et al., 1987), то, начиная с 1993 года, стали появляться работы, выполненные и на других видах животных. Так, была продемонстрирована успешная инфекция освобожденных от блестящей оболочки предимплантационных эмбрионов коров репликативным дефектным ретровирусным вектором на основе MoMLTV, у которого собственная оболочка была замещена на оболочку вируса лейкемии гиббона (Kim et al.,
