Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
7. Проблемы и перспективы...
193
Наряду с интеграцией трансгена с геномом в некоторых довольно редких случаях трансген оказывается способным к экстрахромосомной репликации. В частности, мы наблюдали подобное при работе с трансгенным тутовым шелкопрядом (см. статью Николаева, наст, сборник).
МЕСТА ИНТЕГРАЦИИ
Существует общее мнение, что при трансгенозе чужеродная ДНК может встраиваться в произвольные участки генома. Между тем постепенно накапливаются данные, свидетельствующие о том, что существуют некоторые “предпочтительные” зоны, с которыми интегрирует экзогенная ДНК. Таковыми, по-видимому, являются транскрибирующиеся участки генома, “горячие” точки рекомбинации, области начала репликации и др. Нами, а также рядом других авторов, было установлено, что места интеграции чужеродной ДНК с геномом мыши часто содержат повторяющиеся последовательности. В специальной серии экспериментов нами были охарактеризованы последовательности генома, прилежащие к трансгенам, у семи различных линий трансгенных мышей и одной линии трансгенного кролика (Тарантул и др., 1989). Непосредственно рядом с трансгенами у этих животных во всех 8 случаях были обнаружены умеренные и (или) частые (обращенные) повторяющиеся последовательности генома мыши. Оценка вероятности такого события, сделанная на основании данных о структуре генома мыши, указывает на склонность интеграции трансгенов с повторяющимися элементами ДНК. При этом высокомолекулярные фрагменты ДНК, содержащие трансген, у разных трансгенных животных отличались по GC-содержанию. В литературе также имеются многочисленные данные, указывающие на соседствование трансгенов и повторов. Несмотря на то, что в геноме мышей содержится довольно много повторяющихся элементов, имеющиеся данные (как наши, так и данные литературы) позволяют сделать предположение об участии (прямом или косвенном) повторяющихся элементов генома в интеграции с чужеродной ДНК. Возможно, это связано с повышенной склонностью этих участков генома к рекомбинациям. В частности, детальный анализ структуры участка генома трансгенной мыши, в который произошло внедрение трансгена, показал, что в одной из фланкирующих трансген последовательностей на расстоянии 60 п.н. от точки интеграции присутствуют перекрывающиеся между собой короткие прямые и обращенные повторы. В этой же фланкирующей последовательности на расстоянии 0,3-1 т.п.н. от трансгена имелась протяженная (—3,5 т.п.н.) последовательность, повторяющаяся в геноме мыши 100-300 раз и характеризующаяся высокой консервативностью (гомологи этого повтора выявлены в геномах других видов млекопитающих, птиц, рыб и насекомых) (Тарантул и др., 19866; Tarantul et al., 1986). Это неизвестное ранее семейство диспергированных повторов было названо нами Т1. Предполагается, что обнаруженные короткие обращенные повторы, способные формировать шпильки с петлями, и повтор Т1 являются структурами, участвовавшими в процессе негомологичной встройки чужеродной ДНК в данный участок генома трансгенной мыши (Макарова и др.,
1988).
194
ПЕРЕСТРОЙКИ ГЕНОМА И ТРАНСГЕНОВ ПРИ ТРАНСГЕНОЗЕ
Уже в первых работах по переносу генов и получению трансгенных животных было замечено, что экзогенная ДНК, перенесенная с помощью микроинъекции в пронуклеус зиготы, при интеграции с геномом клеток-хозя-ев может претерпевать значительные изменения по сравнению с исходной молекулой, структура трансгена может быть существенно изменена за счет различного рода мутаций: инверсий, делеций, точечных мутаций. Такие явления наблюдали Гордон с соавт. уже в самой первой работе по трансгенозу (Gordon et al., 1980).
В наших экспериментах по получению трансгенных мышей с вирусными геномами (RSV, аденовирус) также наблюдались различного рода аномалии, происходящие с трансгенами (Газарян и др., 1985; Tarantul et al., 1986). Многочисленные эксперименты, в которых мы вводили интактный RSV в зиготы мышей, не привели к созданию трансгенных животных. Интеграцию провирусных последовательностей с геномом мыши, сопровождающуюся перестройками внедренных последовательностей, наблюдали лишь при введении в зиготы мышей плазмиды, содержащей часть кольцевой формы ДНК RSV (около 2/3 длины), которая включала в себя два LTR, гены src и gag и части генов ро! и env. При этом интеграция плазмиды не происходила по LTR, что согласовывалась с некоторыми данными литературы. Для этого, видимо, необходимо присутствие дополнительных факторов, таких, например, как вирусные ферменты. Интересно, что последовательность про-вирусной ДНК RSV, претерпевшая перестройки при интеграции с геномом мыши, транскрибировалась (Газарян и др., 1985).
При работе с трансгенными мышами, содержащими ДНК аденовируса SA7, нами был выявлен неожиданный феномен. Анализ различных органов двух разных линий мышей Fc-F3 поколений показал, что трансген специфически элиминировался из сердца и скелетной мускулатуры (Gazaryan et al., 1984; Тарантул и др., 1986а). Интересно, что в повторной, независимой серии экспериментов по инъекции ДНК аденовируса SA7 в зиготы мышей факт отсутствия трансгена в сердце и мышцах первых двух поколений мышей полностью подтвердился. Это свидетельствовало о том, что скорее всего наблюдаемые изменения были обусловлены не столько положением трансгена в геноме, сколько самой его природой. Было показано также преимущественное встраивание в хозяйский геном последовательностей левого конца генома аденовируса, где расположен онкоген (Кузнецова и др., 1989).
