Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Основа этой новой методологии была заложена еще в экспериментах по генетической трансформации клеточных культур (см. статью Гривенникова и др., наст, сборник). Если в начальных экспериментах по переносу генов использовали простую инкубацию клеток в среде с экзогенной ДНК, то с появлением селективных сред, позволяющих выявлять и размножать трансформированные клетки in vitro, стали усложняться и методы переноса ДНК в соматические клетки животных (в виде рекомбинантных вирусов, клонированных генов в составе кольцевых и линейных векторов, упакованных в ли-посомы, и др.). Эффективность трансформации клеток повышали разными способами: переносом ДНК в клетки, обработанными вирусом Сендай, по-лиэтиленгликолем, диметилсульфоксидом, инкубацией ДНК в поликатионе диэтиламиноэтилдекстрана, с помощью соосаждения кальций-фосфатным комплексом, электропорацией, путем обстрела клеток частицами вольфрама, золота, титана с сорбированными на них молекулами ДНК, заключением донорской ДНК, метафазных хромосом или интерфазных ядер в липосо-мы, введением ДНК в реконструированные оболочки вирусов и, наконец, микроиньекциями раствора ДНК с помощью прокола клеток и их ядер микроиглой (Серов, 1985; Houdebine, 1997).
Основой для манипуляций с оплодотворенными и неоплодотворенными яйцеклетками млекопитающих послужило развитие техники получения до-имлантациониых зародышей, культивирования их в синтетических средах in vitro, последующего переноса приемной матери и рождения организма. В это же время появились методические приемы разделения зародыша на части или, напротив, слияния нескольких зародышей для получения так называемых химер (Мак-Ларен, 1979). В экспериментах Лина с помощью микрохирургической техники было показано, что инъекция растворов определенных объемов в цитоплазму или отсасывание части цитоплазмы из оплодотворенной яйцеклетки (зиготы) мыши не сказывается на нормальном развитии зародышей и не препятствует рождению здорового потомства (Lin. 1967). В середине 70-х годов были опубликованы первые работы по инъекции ДНК вирусов в полость бластоцисты мышей (Jaenisch, 1974, 1976), в которых была доказана способность чужеродной вирусной ДНК интегрировать с геномом хозяина и затем передаваться по наследству. И, наконец,
185
в 1980 г. с помощью микроинъекций “голой” ДНК в мужской пронуклеус зиготы мыши были получены первые животные, содержавшие в своем геноме искусственно введенную экзогенную ДНК (Gordon et al., 1980; Gordon, Ruddle, 1981). Такие животные в дальнейшем и были названы трансгенными, а сам процесс их получения - трансгенозом. Первоначальный вариант трансгеноза, использованный Гордоном, сейчас называют классическим (рис. 59).
В 1979 г. в Институте молекулярной генетики АН СССР и на кафедре эмбриологии МГУ были начаты совместные эксперименты по переносу чужеродной генетической информации в геном млекопитающих путем прямой микроинъекции ДНК в пронуклеусы зигот мыши. Первые результаты по интеграции чужеродной ДНК (ДНК аденовируса SA7 обезьян) с геномом мыши были получены нами в 1981 г. независимо от появившихся в это время зарубежных работ (см. обзор: Газарян, 1985). Уже к концу 1982 г. в Институте молекулярной генетики было получено пять поколений трансгенных мышей, в геноме которых содержались полные копии или фрагменты ДНК высокоонкогенного обезьяньего аденовируса SA7 (Эшкинд и др., 1982; Газарян и др., 1983).
Техника и процедура трансгеноза, использованные в наших работах, изображены на рис. 60 и 61.
Первоначально для трансгеноза использовали главным образом ДНК различных вирусов и отдельные вирусные гены, так как клонирование эукариотических генов в то время только начиналось. Было показано, что в целом экзогенная ДНК при ее микроинъецировании в зиготы мышей способна интегрировать с геномом хозяина, экспрессироваться в клетках и стабильно передаваться потомству. Наряду с этим уже в первых работах наблюдались случаи изменения структуры как самих трансгенов, так и фланкирующих их последовательностей ДНК хозяина (образование конкатенатов, перестройки, делеции и др.) (Серов, 1985; Tarantul et al., 1986; Palmiter, 1998).
На начальном этапе работ по трансгенозу многие авторы в качестве экзогенной ДНК использовали ген тимидинкиназы (tk) вируса простого герпеса (HSV). Пг)и этом высокие уровни экспрессии гена rf:-HSV наблюдали в различных органах и тканях трансгенных мышей в случае, когда ген находился под контролем сильного промотора металлотионеинового гена 1 (Л/7-7) мыши (Brinster et al., 1981). В работах отечественных авторов активность вирусной тимидинкиназы была выявлена и в тех случаях, когда ген f?-HSV не имел чужого промотора (Дыбан, Городецкий, 1983). В серии наших работ по введению гена Мг-HSV в зиготы мышей было показано, что присутствие в плазмиде длинных концевых повторов (LTR) ретровирусов -LTR провируса саркомы Рауса (RSV) или LTR эндогенного ксенотропного провируса лейкоза мышей (MuLV) - способствовало переносу и экспрессии чужеродной ДНК (Газарян и др., 1984).
С развитием техники молекулярного клонирования генов число публикаций по получению и исследованию трансгенных мышей стремительно росло, постепенно расширялся спектр проблем и задач, решаемых с помощью трансгеноза. Одной из самых впечатляющих работ на ранних этапах развития трансгеноза были эксперименты Пальмитера с соавт. (Palmiter et al., 1982) по микроинъекции в зиготы мышей гена гормона роста (ГГР) крысы, находящегося под контролем промотора гена МТ-1 мыши. Перенос та-
