Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
линейную корреляцию указанных величин для всех исследованных клеточных
линий, за исключением эритроцитов. График построен по данным работы
Sherbet, 1978.
(Righetti et al., 1980.)
значительно более глубокого электрокинетического зондирования клеточной
поверхности, чем при обычном зональном электрофорезе. Так, если на
подвижности клеток при обычном электрофорезе сказывается вклад ионогенных
групп, расположенных на глубине до 1,4 нм от поверхности, то при ИЭФ
тестируемая глубина может быть по крайней мере в 5 раз больше, т. е
достигать 6-7 нм. Кроме того, используя определенные с помощью ИЭФ
значения pi клеток, можно рассчитать поверхностную плотность заряда (о),
а также электрофоретическую подвижность (перечень значений pi различных
клеток приведен в табл. 5.2). В свою очередь можно провести линейную
корреляцию между плотностью зарядов (числом зарядов на 1 см2 клеточной
поверхности) и электрокинетическим потенциалом (?-по-тенциалом) в том
случае, если последний не превышает 27 мВ. Исходя из этого, я попытался
графически оценить точность полученных Шербетом данных. Как видно из рис.
5.4, налицо достаточно хорошая корреляция между значениями pi и
поверхностной плотностью заряда для 11 клеточных линий животных. Для 10
клеточных линий со значениями pi в диапазоне 4,5-7,0 соответствующие
точки почти идеально ложатся на прямую (декремент о составляет около
0,85* 10"13 "см~2 на одну единицу pH). Сильное отклонение от линейной
зависимости наблюдается только в случае эритроцитов человека. Судя по
графику.
Некоторые применения метода ИЭФ
339
Рис. 5.5.^>Зависимость электрокинетического потенциала (^-потенциала)
различных клеточных линий от поверхностной плотности заряда. График
построен по данным работы Sherbet, 1978. (Righetti et al., 1980.)
плотность заряда у клеток с pi 5,5 (это значение приведено в работе Just
et al., 1975а) должна быть вдвое выше. Если же исходить из значения а, то
изоточка эритроцитов должна быть около 6,3. Эритроциты - это, вероятно,
наиболее полно изученные клетки млекопитающих, поэтому наблюдаемое для
них отклонение от общей линейной зависимости весьма подозрительно. При
построении зависимости ^-потенциала от плотности заряда опять-таки
наблюдается линейность (рис. 5.5), однако с большим разбросом точек
(около половины всех точек заметно отклоняется от прямой).
И все же, несмотря на значительное число экспериментальных данных,
процесс ИЭФ клеток нельзя считать полностью отработанным. Так, по данным
Castimpoolas, Griffith, 1977, при ИЭФ лимфоцитов из селезенки мыши
сфокусированные зоны быстро дефокусируются, а клетки в конце концов
лизируют. Авторы предполагают, что попадание клеток в изоэлектрическую
область стимулирует процессы перестройки-в их мембранах, которые приводят
к смещению эффективного значения pi клеток в более кислую Область, что в
свою очередь заставляет их мигрировать по направлению к зоне этого нового
значения pi (т. е. дефокусироваться). Это может повториться несколько
раз, до тех пор пока очередная мембранная перестройка не окажется столь
серьезной, что вызовет лизис клеток. В самом деле, несмотря на
многочисленные заверения в том, что клетки после ИЭФ сохраняют
жизнеспособность (до 90% в опытах, ос-
22'
340
Глава 5
нованных на вытеснении красителя; см. работы Hirsch, Gray, 1976; Manske
et al., 1977), оказывается, что реальная жизнеспособность клеток,
тестируемая по эффективности посева, как правило, достаточно низка (Boltz
et al., 1977). В работе Longton et al., 1974, показано, что клетки,
рекультивированные после ИЭФ, в течение длительного времени оказываются
неспособными к размножению. Эти наблюдения привели к распространению
предположения о том, что амфолиты-носители в некоторой степени
цитотоксичны. Таким образом, следует критически проанализировать проблему
мембранной стабильности и соответственно жизнеспособность клеток в
условиях ИЭФ. Открытым остается пока и вопрос о том, соответствует ли
эффективное значение pi, определяемое при ИЭФ клеток, "истинному" изо-
электрическому равновесию между положительно и отрицательно заряженными
группами клеточной поверхности. Например, значение р1=5,6 клеток Е. coli
(Sherbet, 1978) практически совпадает с pi эритроцитов (см. рис. 5.4). В
то же время отношение суммарного отрицательного заряда к положительному
для Е. coli составляет 2: 1 (2,899 • 10-13 см-2 отрицательно заряженных
карбоксильных групп на 1,433-Ю-13 см-2 положительно заряженных групп), а
для эритроцитов - 25 : 1 (Seaman, 1975), т. е. несравнимо больше. Трудно
представить себе, чтобы эти два вида клеток характеризовались одинаковыми
значениями pi.
Помимо всего прочего следует учитывать еще три обстоятельства, которые
также могут отрицательно сказаться на достоверности данных, полученных
при ИЭФ клеток. А именно: (а) после достижения равновесия в системе
сфокусированные амфолиты-носители образуют среду с очень низкой ионной
силой: по последним данным, в диапазоне 0,5-1 мг-ион/л для 1%-ных
