Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
(Boltz et al., 1977). С помощью ИЭФ в фиколл-сахарозном градиенте
анализировали клетки асцитной опухоли Эрлиха и гепа-тоциты у крыс (Manske
et al., 1977). В градиенте фиколла проводилось даже выделение кабаньих
(Moore, Hibbit, 1975) и кроличьих сперматозоидов (Hammerstedt et al.,
1979).
В работах Sherbet, 1978, и Langton et al., 1975, сообщалось, об ИЭФ
бактерий. Согласно данным Talbot, 1975; Mandel, 1971; Chlumechka et al.,
1973, и Rice, Horst, 1972, ИЭФ может быть, использовано и для
фракционирования вирусов.
Таблица 5.1. Равновесный изоэлектрическнй анализ клеток Е. coli после
обработки различными способами1^
Наблюдаемое значение рХ Ионогенные группы в изоэлектрической
зоне2) Расчетное значение pH) Число чис-
Способ обработки клеток вероятно, присутствуют не берутся в
расчет тых зарядов на клетку (-10-V)
Контроль (необработанные 5,60+0,10 клетки Е. coli)
Кислота (отмывка)/этилени- 8,55+0,04 мин
3,85+0,06
4,28+0,05
Формальдегид
6,6 -дитиодиникотиновая кислота
Кислота (отмывка)/этилени- 7,47+0,18 мин/6,6'-дитиодиникоти-новая кислота
-СООН; -NH2 (р/С=7,5) Кислые группы с р/(<3,2;
е-аминогруппы лизина -NH2 (р/С=7,5) Аминогруппы фосфолипи-
дов; фенольные гидроксилы; гуанидиновые группы -СООН5* Кислые группы с
р/(<3,2
-СООН; -NH2(p/C=7,5) Меркаптогруппы6>
-NH2 (р/С=7,5)
Меркаптогруппы6)
5,38 -0,37
8,7 +0,41
3,5 -0,84
') Все данные - по Sherbet, Lakshmi, 1975.
2) Считается, что в число групп, определяющих изоэлектрические свойства
клеток, входят группы, удаленные от поверхности на глубину до 6,0 нм.
3) Значения pi рассчитаны на основании данных о р/С ионогенных групп,
скорректированных с помощью уравнения Хартли - Рои: р1 =
*=-log(2A'a'Jk'w/Hk'b) , где k'a и krb - скорректированные константы
диссоциации наиболее сильных анионогенных и катионогенных групп
соответственно, а ^^ = 6,81 -10~15 при 20 °С.
*) Результирующее число отрицательных зарядов на поверхности клетки (Q)
рассчитано по формуле Q=PDr2K-3,3' 10~г/е (Sherbet et al., 1372),
Величина поверхностного потенциала Р оценивается как разность потенциалов
между раствором при нейтральном pH и раствором при pH, равном pi
клеточной поверхности, и определяется выражением (7-pi)-2M3RTIF, где /? -
универсальная газовая постоянная (8,315 Дж/К*моль), Т - абсолютная
температура (в К), F - постоянная Фарадея (96 500 Кл/моль). При 25 °С
значение выражения 2,303Д77/'=0,592, D - диэлектрическая постоянная воды
(равная 78,54 при 25 °С); г - радиус клетки (в см); /( - функция Дебая -
Хюккеля (0,327-108 /1/2 при 25 °С), где / - ионная концентрация амфолитов
(для амфолинов в этих условиях она полагается равной 0,01 М); е - заряд
электрона (1,6-10~19 Кл).
&) Карбоксильные группы глюкуроновой и нейраминовой кислот, р-СООН
аспарагиновой кислоты, у-СООН глутаминовой кислоты.
е) Число меркаптогрупп на поверхности клеток соответствует числу
отрицательных зарядов, введенных при реакции с 6,6'-дитиодиникотино-воЛ
кислотой (около 0,35-10е групп). При физиологических значениях pH лишь
небольшая доля этих групп (менее 3%) находится в диссоциированной форме.
Некоторые применения метода ИЭФ
337
Таблица 5.2. Значения pi клеток животных, (бактерий и вирусов,
определенные методом изоэлектрического равновесия1)
Объект
Литературный источник
Hela, карцинома шейки матки НеГа, обработанные у-глобули-нами
Асцитная саркома Иосиды Асцитная опухоль Эрлиха Клетки Ру
Нормальные клетки печени Гепатома крысы Мышиные фибробласты ЗТЗ Клетки
SV-3T3 SV-CHK SV-TRK Ру-ЗТЗ Астроцитома человека
I поколение
II поколение
III и IV поколения Менингиома человека Клетки мозга эмбриона человека
Escherichia coli Эритроциты человека Эритроциты мыши Эритроциты кролика
Сперматозоиды кабана Вирус желтой мозаики репы Вирус хлоротической
крапчатости вигны китайской Бактериофаг QjJ Помощник вируса некроза
табака
Вирус мозаики костра Поксвирусы Вирус ящура
Sherbet et al., L9722>
Sherbet, Lakshmi (не опубл.)2) Sherbet, Lakshmi (не опубл.) 3>
Sherbet, Lakshmi, I9763>
Sherbet, Lakshmi, 1974")
Sherbet, Lakshmi, 1973, 19752>
Just et aL, 1975 Moore, Hibbit, 1975
Rice, Horst, 19724>
6 8
4,0 ' Hill et al., 19635> 6,9и4,3 Talbot, 1975
¦) Все данные в таблице (кроме последней строки) взяты из книги Sherbet,
1978. 2) pi определяли при 25 °С в 0,008 М растворе амфолинов.
8) pi определяли в 0,009 М растворе амфолинов.
4) pi определяли в 2%-ном растворе амфолинов.
6) р! определяли электрофоретически.
В фундаментальном исследовании, посвященном электрофорезу и ИЭФ клеток
(Sherbet, 1978), показано, что ИЭФ можно использовать для измерения
плотности поверхностного заряда клеток, для определения значений рК
ионизирующихся групп на клеточной мембране, а также для контроля за
химической модификацией заряженных групп клеточной оболочки (табл. 5.1).
По данным Sherbet, 1978, с помощью ИЭФ можно добиться
22-1488
338
Глава 5
Рис. 5.4. Зависимость значений pi, определенных с помощью ИЭФ, от
поверхностной плотности заряда клеток. Обратите внимание на четкую
