Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
ИЭФ удается различить все пять ожидаемых зон, а при электрофорезе -
только две (Basset et al., 1982).
Эффект Бора. Как было показано в работе Perutz, 1970, восстановленный
гемоглобин находится в напряженной, так называемой Т-форме (от англ.
taut), жесткая структура которой поддерживается множеством внутри- и
межсубъединичных ионных связей. При связывании с гемом лигандов, таких
как СО
Рис. 5.14. Сравнение профилей ИЭФ гемолизатов: I - нормальная кровь, II -
кровь, содержащая гемоглобин Syracuse. Слева - гемоглобин, насыщенный СО;
справа - дезоксигемоглобин. Более высокое разрешение, наблюдаемое в
случае ИЭФ гемоглобинов А и Syracuse, лишенных лиганда, вызвано тем, что
для последнего характерен относительно слабый эффект Бора. (Jensen et
al..
Некоторые применения метода ИЭФ________________________35$
Рис. 5.15. Схематическое представление обнаруживаемых с помощью ИЭФ
изменений pi (Др1) при переходе различных гемоглобинов человека из дезок-
си- в окси-форму. Все мутантные гемоглобины характеризуются более низкими
по сравнению с НЬА0 (крайний слева) значениями Др1 и более слабым
эффектом Бора в растворе. Штриховые прямые с идущими от них стрелками
указывают разность между значениями Др1 для НЬА0 и для мутантных
гемоглобинов. Направление стрелок предположительно указывает, на каком из
двух альтернативных значений pi (дезокси- или окси-формы) в большей
степени сказывается та или иная мутация. (Poyart et al., 1981.)
или 02, ионные связи разрываются и происходит кооперативный переход белка
в ненапряженную R-форму (от англ. relaxed), которая характеризуется
значительно более высоким сродством к лигандам. Известно, что не
содержащая кислорода Т-форма более прочно связывает протоны, чем R-форма,
и, уаким образом, дезокси-Hb характеризуется значительно более высоким
значением pi, чем окси-Hb. Это легко продемонстрировать с помощью ИЭФ
(Bunn, McDonough, 1974): пурпурная полоса дезокси-Hb имеет pi 7,07, что
примерно на 0,12 ед. pH выше, чем изоточка красной полосы карбонил-Hb (pi
6,95). Зная это, для улучшения разрешения при ИЭФ гемоглобина А и
некоторых мутантов с очень близкой изоточкой можно воспользоваться
эффектом Бора в том случае, если мутанты аномальны в
23-1488
354
Глава 5
этбм отношении. На практике это было продемонстрировано для случая
мутантного Hb Syracuse (Jensen et al., 1975). Этот мутантный гемоглобин,
не отделяющийся от НЬА при обычном электрофорезе, характеризуется очень
высоким сродством к кислороду и примерно вдвое меньшим (по сравнению с
нормой) эффектом Бора. При ИЭФ наблюдается лишь частичное разделение
окси-форм и значительно более полное разделение дезоксиформ нормального и
мутантного гемоглобинов (рис. 5.14).
С помощью ИЭФ можно весьма точно оценить характерный щелочной эффект Бора
для нормального и мутантного гемоглобинов человека (Poyart et al., 1981).
Эффект Бора оценивается по разности между значениями pi гемоглобинов,
полностью лишенных лигандов (дезоксиформа), и полностью насыщенных СО
(Др1). Для гемоглобина А значение Др1 составляет 0,17 ед. pH, что
соответствует различию в 1,2 положительных заряда между окси- и
дезоксиформами тетрамерного НЬА. Для мутантных или химически
модифицированных вариантов НЬА, содержащих измененные N- или С-концевые
участки последовательности в a-цепях, значение Др1 может уменьшаться на
30%. При изменении С-концевого участка последовательности в (5-це-пй, как
в HbNancy, значение Др1 оказывается на 70% меньше, чем для нормального
НЬА (рис. 5.15). Более того, даже для гемоглобинов, характеризующихся
обычным значением ДрЬо/ДрН, с повышением pi оксиформы наблюдается
снижение Др1, что свидетельствует о pH-зависимости эффекта Бора. Эти
данные, полученные на основе ИЭФ, хорошо согласуются с существующими
представлениями о соответствующем вкладе функциональных групп двух
аминокислотных остатков, Val-la и His-1460, играющих важнейшую роль в
реализации характерного щелочного эффекта Бора (Kilmartin et al., 1973;
Perutz et al., 1980). На мутантных гемоглобинах было также показано, что
наблюдаемое значение Др1 может уменьшаться или даже становиться равным
нулю в тех случаях, когда замены аминокислотных остатков приводят к
дестабилизации одной из двух или обеих возможных четвертичных структур
тетрамера и (или) к заметному уменьшению величины L-аллостерической
константы.
Степень окисления железа в геме. Некоторые мутантные гемоглобины, несущие
замены проксимального (F8) или дистального (Е7) остатков гистидина,
проявляют склонность к спонтанному окислению или элиминации гема. К
первой группе принадлежат гемоглобины типа М. Известны четыре гемоглобина
этого типа, в каждом из которых один из четырех функционально важных
остатков гистидина а- и 0-цепей замещен на остаток тирозина, что приводит
к образованию прочной связи с окислен-
Некоторые применения метода ИЭФ 355
Рис. 5.16. Профили ИЭФ в геле гемолизатов, содержащих мутантный
гемоглобин М Saskatoon. Слева - фракционирование оксиформ с относительно
