Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 140

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 134 135 136 137 138 139 < 140 > 141 142 143 144 145 146 .. 171 >> Следующая

обработки гель обдували воздухом до обесцвечивания фона, зоны вырезали,
пептид элюировали 80%-ной уксусной кислотой, а затем проводили
солянокислый гидролиз и автоматический аминокислотный анализ гидролизата.
(Gianaz-
za et al., Г980Ь.)
334
Глава 5
графии. Хотя мол. масса амфолитов-носителей, как правило, не превышает
1000, склонность к агрегации в растворе (Bianchi Bosisio et al., 1981)
препятствует их отделению даже от значительно более высокомолекулярных
пептидов. Недавно были исследованы возможности разделения амфолитов-
носителей и пептидов с помощью гидрофобной хроматографии на октил-се-
фарозе (Gelsema et al., 1980b). Впрочем, не следует рассчитывать на то,
что этот метод может решить проблему полностью, хотя бы потому, что
пептиды с Мг<5000, как правило, не связываются с гидрофобными сорбентами
(Hjerten, 1974). Это согласуется и с выводами, к которым приходят, авторы
вышеупомянутого исследования: "С помощью гидрофобной хроматографии в
присутствии соли, как правило, не удается разделить амфолиты-носители и
пептиды с молекулярной массой в наиболее важном диапазоне (скажем, от
2000 до 8000)".
В качестве другого подхода к решению этой задачи можно было бы
использовать ИЭФ пептидов в присутствии сравнительно низкомолекулярных
амфолитов-носителей (для амфолинов среднее значение -Мг=750). Синтез
таких низкомолекулярных амфолитов (среднее значение Afr=300) был описан в
работе Gasparic, Rosengren, 1975. Однако эти амфолиты никогда не
применялись собственно для фракционирования пептидов, а кроме того, в
настоящее время они не поступают в продажу. В работе Righetti, Hjerten,
1981, была сделана попытка подойти к решению этой же задачи с другой
стороны, т. е. вместо того чтобы уменьшать молекулярную массу амфолитов,
авторы предприняли синтез нёобычно высокомолекулярных амфолитов-носителей
(см. также разд. 1.7.4). Раствор высокомолекулярного полиэтиленимина (Мт
40000-60000) смешивали в проточном реакторе с линейным градиентом
акриловой кислоты и проводили синтез при 80 °С в течение 70 ч. Таким
образом удалось получать гигантские амфолиты-носители с Мт в диапазоне
50000-90000. Несмотря на то что эти амфолиты весьма склонны к агрегации и
преципитации, особенно в кислом диапазоне pH, с белками они связываются
непрочно и обратимо. Не было обнаружено никакого взаимодействия с
модельными дипептидами (His-Ser, His-Met, His-Phe и His-Lys), которые при
препаративном фракционировании удавалось получать с выходами около 85%.
Все эти данные указывают на то, что, несмотря на определенные трудности,
имеются реальные возможности для осуществления как аналитического, так и
препаративного ИЭФ пептидов. Можно полагать, что и эти трудности удастся
полностью преодолеть с помощью разработанного недавно метода
фокусирования в иммобилизованном градиенте pH (система Immobili-пе,
производство фирмы LKB).
Некоторые применения метода ИЭФ
335
Последние данные, полученные нашей группой (Gianazza*. Righetti,
неопубликованные результаты), свидетельствуют о том,, что сфокусированные
пептидные зоны в этом случае можно проявлять с помощью опрыскивания
нингидрином, флюоресками-ном или любым другим реагентом на первичную
аминогруппу,, поскольку иммобилизованные буферные компоненты с этими,
реагентами не взаимодействуют. С точки зрения препаративного
фракционирования метод иммобилизованных градиентов. pH удобен тем, что он
допускает внесение значительных количеств образца и позволяет выделить
сфокусированные пептиды, без примесей буферных компонентов, которые
ковалентно пришиты к матрице. Можно не сомневаться, что применение этого-
нового метода позволит добиться значительных успехов в области химии
пептидов.
5.2. ИЭФ клеток, субклеточных частиц, бактерий и вирусов
Впервые ИЭФ клеток было осуществлено в работах Sherbet et al., 1972, и
Sherbet, Laksmi, 1973, с использованием стационарного линейного градиента
концентрации сахарозы (10- 55%), глицерина (10-70%) или фиколла (5-30%),
содержащего 1%-ные амфолины, в стандартной колонке фирмы LKB-объемом 110
мл. Процесс ИЭФ клеток в этих условиях занимал около 30 ч. Впоследствии
был предложен метод проточного изоэлектрического фракционирования клеток
(Just et al., 1975а,b; Just, Werner, 1977a,b). ИЭФ проводили в
модифицированном аппарате Ханнига, и время пребывания клеток в про^
точной камере аппарата составляло всего лишь 7-10 мин. О фокусировании
клеток сообщалось и в некоторых других публикациях. В работе Leise, Le
Sane, 1974, разделение лимфоцитов периферической крови человека и кролика
осуществляли с помощью ИЭФ в градиенте декстрана-40, а в работе Hirsch,
Gray, 1976, ИЭФ лимфоцитов периферической крови крысы проводили в
декстрановом градиенте, приготовленном на изотоническом сахарозном
растворе. Сообщалось об изоэлектрическом фракционировании фибробластов
китайского хомячка в линейном градиенте фиколла, изотонические свойства
которого по всему объему поддерживались с помощью сахарозы и глюкозы
Предыдущая << 1 .. 134 135 136 137 138 139 < 140 > 141 142 143 144 145 146 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed