Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
невысоким разрешением красной полосы НЬА и коричневой полосы НЬМ
Saskatoon. Справа - фракционирование после обработки феррицианидом;
разрешение полос НЬА и НЬМ Saskatoon значительно повышается. (Bunn et
al.,
1977.)
ным гемом. Во вторую группу входят неустойчивые мутантные гемоглобины,
такие, как Gun Hill (Bradley et al., 1967) и St. Etienne (Beuzard et al.,
1972), в которых остаток His p-цепи в первом случае отсутствует
(делеция), а во втором замещен на остаток глутамина. В этих гемоглобинах
невозможно связывание гема с p-цепями. За счет изменения степени
окисления железа в геме можно достичь значительно более высокого
разрешения при ИЭФ гемоглобинов типов М и А. Так, обычно НЬМ Saskatoon
(p63:His->-Tyr) (Bunn, 1977) и HbM Bicetre (Р63: His-кРго) (Wajcman et
al., 1976) фокусируются в виде четких коричневых полос с pi несколько
выше, чем pi красной полосы нормального НЬА. Нормальный и мутантные гемо-
.глобины разделяются не полностью, что осложняет их количественное
определение при сканировании. С другой стороны, после ркисления
феррицианидом достигается значительно более полное разделение
гемоглобинов М и А (рис. 5.16). Метгемо-глобин А имеет существенно более
высокую изоточку (т. е. несет больше поверхностных положительных
зарядов), чем мет-гемоглобин М, поскольку в аномальных субъединицах
последнего заряд ионов Fe(r)+ частично компенсируется а'номальными
аминокислотами (Туг вместо His).
Валентные гибриды. Окисленные формы не ограничиваются только мутантными
гемоглобинами. Оказывается, что in vitro нормальный гемоглобин взрослого
человека также подвержен спонтанному аутоокислению. Однако in vivo в
норме гемоглобин в основном находится в восстановленной форме, поскольку
для нормального функционирования в организме гем должен содержать ион
Fe2+. Гемоглобин, содержащий ион железа в сте-
23*
356
Глава 5
Рис. 5.17. Фракционирование окисленных форм гемоглобина человека при. ИЭФ
гемолизатов в 0,05 М фосфатном буфере pH 7,1. Слева - гемолизат без
добавления окислителя; в центре - гемоглобин, частично окисленный при
добавлении 0,5 эквивалента феррицианида; справа - гемоглобин, полностью
окисленный при добавлении избытка феррицианида. На приведенных профилях
ИЭФ •содержание ферригемоглобина составляет 50 и 100% соответственно.
(Bunn,
Drysdale, 1971.)
пени окисления III (метгемоглобин), не способен связывать кислород.
Несмотря на существенные различия в заряде между Ре2+-гемоглобином (агРг)
и разнообразными окисленными формами (а+2р2. агР2+, а2+Рг+). эти формы не
удавалось обнаружить с помощью традиционного электрофореза. Напротив, при
ИЭФ удается отчетливо разделить и идентифицировать как полностью
окисленные формы, так и частично окисленные интермедиаты. Так, после
неполного окисления НЬА феррицианидом при ИЭФ в геле появляются три новые
полосы (рис. 5.17). Полностью окисленный гемоглобин (а2+р2+) проявляется
в виде коричневой полосы с pi 7,20, т. е. на 0,25 ед. выше, чем pi
неокисленного НЬА (Bunn, Drysdale, 1977). На равном удалении от полностью
окисленной и полностью восстановленной форм находятся две близкие полосы
(обозначены IBi и 1Вц), которые, как было по-
Некоторые применения метода ИЭФ
357
Г- _ :s *
(а) (б) (в) (а) (б) (в)
Рис. 5.18. Профили ИЭФ (-23 °С) различных образцов гемоглобина. Стрелка
указывает направление возрастания ран]) в гелях. А. (а)-готовили смесь
<Х2+р2+ с а2со|32со, инкубировали 5 мин при О °С; реакцию обмена
останавливали и смесь разделяли с помощью ИЭФ при -23 °С, как описано в
тексте; (б) -смесь а2+р2+ с а2С0р2С0 инкубировали при -23 °С и ран-8,5 в
течение 30 мин перед ИЭФ; (в)-то же, что и (б), но при ран-7,5. Б. (а) -
<*2+р2с0; (б)-ct2cop2+; (в)-смесь а2+р2С0 и а2с°р2+ инкубировали при
0°С в течение 5 мин; останавливали реакцию обмена охлаждением до -23 °С.
В. (а) -смесь а2+р2+, а2*Ц&2со и а2С0р2С0 инкубировали при -23 °С и рэн=
=8,5 в течение 5 мин перед ИЭФ; (б) -смесь а2+р2+ и а2+р2С0 инкубировали
5 мин при 0°С и затем охлаждали до -23 °С; (в) -смесь а2+р2С0 и а2сор2со
инкубировали 5минприО°С и охлаждали до -23 °С. Г. (а)-смесь а2+р2+,
а2сор2+ и <х2сор2со перед ИЭФ инкубировали в течение 5 мин при -23 °С и
ран=8,5; (б) -смесь а2сор2+ и а2С0р2С0 инкубировали 5 мин при 0°С, а
затем охлаждали до -23 °С; (в) -смесь а2сор2+ и а2+р2+ инкубировали 5 мин
при 0°С и охлаждали до -23 С. (Perrella et al., 1981.)
*) ран - отрицательный десятичный логарифм эффективной концентрации, т.
е. активности ионов водорода (ан). - Прим. перев. "
казано в работе Park, 1973, отвечают формам СС2Р24* и аг+Рй
соответственно. Сам факт разделения двух этих компонентов в данной
системе является дополнительным подтверждением представления о различиях
в микроокружении тема в а- и р-цепях. Эти различия (конформационные
переходы) в свою очередь порождают небольшие локальные различия
поверхностного заряда у двух в целом одинаково заряженных белков.
Оказывается, что в действительности дело обстоит намного
